氯霉素ELISA检测试剂盒说明书.doc

氯霉素（Chloramphenicol）ELISA检测试剂盒说明书一、概要氯霉素 （chloramphenicol, CAP）是应用广泛的抗菌素，曾对畜禽疾病控制和治疗起到了重要作用但由于氯霉素存在严重的副作用，能引起人的再生障碍性贫血，粒细胞缺乏症等疾病，欧美等发达国家已相继禁止或严格禁止使用本试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，能最大限度地减少操作误差和工作强度操作时间仅需1.5小时二、试验原理本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的氯霉素和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其残留物氯霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中氯霉素的含量三、适用范围可定性、定量检测动物组织（肌肉、肝脏等）、尿液、血清、肠衣、牛奶、奶粉等样本中氯霉素的残留量四、 交叉反应率氯霉素 ……………………………………100%；琥珀氯霉素…………………………………92%；氯霉素-葡萄糖苷酸 ………………………57%五、使用单位需自备的设备及试剂设备：┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm┅┅旋转蒸发仪/氮气吹干装置┅┅均质器┅┅振荡器┅┅涡旋仪┅┅离心机┅┅天平：感量0.01g┅┅刻度移液管：10ml┅┅洗耳球 ┅┅容量瓶：100ml、500ml┅┅玻璃试管：10ml┅┅聚苯乙烯离心管：10ml、15ml、50ml ┅┅微量移液器：单道 20ml～200ml、100ml～1000ml多道 250ml 试剂：┅┅乙酸乙酯（分析纯）┅┅乙腈（分析纯）┅┅正己烷（分析纯）┅┅二水合亚硝基铁氰化钠（分析纯）（供奶样用）┅┅七水合硫酸锌（分析纯）（供奶样用）┅┅葡萄糖苷酸酶 (Merck,Art.No.4114)（供尿样本用）┅┅醋酸钠（分析纯）（供尿样本用）┅┅肝素钠（分析纯）（供血样本用）┅┅醋酸（分析纯）（供尿样本用）----去离子水六、提供的材料与试剂1、96孔酶标板×1块 （包被有偶联抗原）2、标准液×6瓶：（2ml/瓶） 0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb3、高浓度标准品：（2ml/瓶） 100ppb4、酶标二抗………………………… 7ml 5、抗体工作液…………………………7ml 6、底物液 A液………………………… 7ml 7、底物液 B液 …………………………… 7ml 8、终 止 液……………………………7ml 9、20×浓缩洗涤液 ………………………40ml 10、2×浓缩复溶液 ………………50ml 七、溶液的配制配液1: C液（供奶样专用）0.36M 二水合亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）溶液称取10.7g二水合亚硝基铁氰化钠加去离子水溶解定容至100ml。

配液2: D液（供奶样专用）1M七水合硫酸锌（ZnSO4·7H2O）溶液称取28.8g七水合硫酸锌加去离子水溶解定容至100ml 配液3: pH4.8 100mM醋酸钠溶液（供尿样本用） 称取 2.4g醋酸钠，加入1.2ml 醋酸，再加去离子水溶解定容至500ml配液4:乙腈-水溶液 量取84ml无水乙腈加入到16ml去离子水中混匀配液5: 复溶工作液用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1体积比进行稀释（1份2×浓缩复溶液+1份去离子水）用于提取样本的复溶，复溶工作液在4℃环境可保存一个月配液6: 洗涤工作液用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月八、样本前处理步骤样本处理前须知处理任何样本时，都必须注意：（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头b）实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果c）处理样本的同时，做空白试剂对照，样本的测定结果减去空白试剂的测定结果为样本中氯霉素的实际残留量组织样本空白对照试剂的制备┅┅取4ml乙酸乙酯在氮气流下完全干燥；┅┅用1ml正己烷充分溶解；┅┅加入1ml复溶液工作液（见配液5），强烈振荡1min，静置分层后去除上层正己烷相；┅┅取100ml水相用于分析。

（d）未处理的样本冷冻保存e）处理后的样本可在2-8℃避光保存24h未加正己烷之前，吹干的样本保存效果更好f）处理后的样本，如出现乳化现象，可在去除部分上层有机相，60℃水浴5～10min消除乳化后，再重复离心步骤一）组织 (鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼等)前处理方法┅┅用均质器均质组织样本；┅┅称取3.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入6ml乙酸乙酯，用振荡器振荡10min，3000g以上，室温（20-25℃）离心10min；┅┅移取4ml上层有机相（约相当于2g的样本）至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；┅┅加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s，再加1ml复溶工作液（见配液5），用涡旋仪涡动1min， 3000g以上，室温（20-25℃）离心15min；┅┅除去上层有机相，取下层100ull用于分析注：在检测动物肝脏样品时, 加入1ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml复溶工作液后，只需振荡10s，离心后取下层即可分析；在检测高脂肪样本时正己烷用量可加大2ml－3ml二）鸡血前处理方法┅┅用加有肝素钠（20-30单位/ml血）的离心管采集鸡血样本（建议采血注射器也用肝素钠润洗），血样本室温静置1h，待析出血浆后，3000g以上，15℃离心10min；┅┅取1ml血浆至10ml聚苯乙烯离心管中，加2ml乙酸乙酯振荡1min；┅┅室温（20-25℃）下静置待水相与有机相完全分层或3000g以上，室温（20-25℃）离心5min；┅┅移取上层的有机相至15ml干净的玻璃试管中，于50～60℃氮气流下吹干；┅┅干燥的残留物加入1ml复溶工作液（见配液5），用涡旋仪涡动2min溶解干燥的残留物；┅┅取100ml用于分析。

三） 尿液前处理方法┅┅将尿液于3000g以上，室温（20-25℃）离心5min，直至尿液样本清亮；┅┅移取2ml清亮尿液样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加0.5ml pH4.8 100mM醋酸钠缓冲液（见配液3）混合；┅┅加40ml葡萄糖苷酸酶 (Merck,Art.No.4114)至稀释的尿液样本中，置37℃水解至少2h（或过夜），取出室温（20-25℃）放置；┅┅该溶液恢复至室温（20-25℃）后加入8ml乙酸乙酯混合1min；┅┅3000g以上，室温（20-25℃）离心10min，取出4ml上层液体至10ml干燥的玻璃试管中，于50～60℃氮气流下吹干；┅┅加入1ml复溶工作液（见配液5），涡动2min溶解干燥的残留物；┅┅取100ml 用于分析四）肠衣前处理方法┅┅用均质器均质样本注：干样本需剪碎（长度不超5mm）后再均质，湿样本需用去离子水漂洗20min以上(去除表面的盐份)，沥干后再进行均质；┅┅称取1.0±0.05 g均质后的样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml乙酸乙酯，振荡10min，3000g以上，室温（20-25℃）离心10min；┅┅取出5ml上层有机相（相当于0.5g的样本）至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；┅┅加入1 ml正己烷，涡动30s，再加0.5ml复溶工作液（见配液5）强烈振荡1min，3000g以上，室温（20-25℃）离心5min；┅┅除去上层有机相，取下层100 ml用于分析。

五）牛奶和奶粉前处理方法（a）牛奶前处理方法┅┅取牛奶样本，3000g以上，10℃离心10min，吸除上层脂肪；┅┅取5ml去除脂肪牛奶样本至10ml聚苯乙烯离心管中，加入150mlC液（见配液1）出现沉淀，振荡15s，再加入150mlD液（见配液2），振荡1min充分混合；┅┅3000g以上，15℃离心10min，移取上层液；┅┅用复溶工作液（见配液5）以等体积稀释上层液（1份上层液+1份复溶工作液）；┅┅取100ml用于分析注：如果离心后仍然浑浊，再重复脱脂过程 （b）牛奶前处理方法┅┅取牛奶样本,3000g以上,10℃离心10min,吸除上层脂肪；┅┅取5ml去除脂肪牛奶样本至10ml聚苯乙烯离心管中，加入250mlC液（见配液1）和250mlD液（见配液2）充分混合，3000g以上，4～12℃离心10min如没有冷冻离心机，请预先将样本冷却到8℃再进行离心）；┅┅移取2.2ml上层液（相当于2ml奶样）至另一个10ml聚苯乙烯离心管中，加入4ml乙酸乙酯上下振荡10min；┅┅3000g以上，室温（20-25℃）离心10min ；┅┅移取2ml乙酸乙酯上层有机相（相当于1ml奶样），至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；┅┅加入0.5ml复溶工作液（见配液5），涡动2min溶解干燥的残留物；┅┅取100ml用于分析。

由于阴性样本可能会产生背景干扰 （在某些情况下干扰数值在标准2到3之间），所以推荐0.15ppb作为阳性结果的cut off判断值奶粉前处理方法┅┅称取2.0±0.05g奶粉至10ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml去离子水，振荡溶解；┅┅加1ml C液（见配液1）和1ml D液（见配液2）充分混合，3000g以上，4～12℃离心10min，（如没有冷冻离心机，请预先将样本冷却到8℃再进行离心）；┅┅移取3.6ml上层液（相当于0.6g奶粉）至另一个10ml聚苯乙烯离心管中，加入6ml乙酸乙酯上下振荡10min；┅┅3000g以上，室温（20-25℃）离心10min；┅┅移取4ml上层有机相（相当于0.4g奶粉），至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；┅┅用0.4ml复溶工作液，涡动2min溶解干燥的残留物；┅┅取100ml用于分析由于阴性样本可能会产生背景干扰 （在某些情况下干扰数值在标准2到3之间），所以推荐0.15ppb作为阳性结果的cut off判断值六）蛋类前处理方法┅┅用均质器低速均质鸡蛋样本，使得蛋清和蛋黄充分混合；┅┅称取3.0±0.05g均质过的蛋样本至15ml聚苯乙烯离心管中，加9ml乙腈-水溶液（见配液4），振荡10min，3000g以上，15℃离心10min；┅┅取3ml上层液与3ml蒸馏水充分混合，加入4.5ml乙酸乙酯，充分混合5min， 3000g以上，15℃离心10min；┅┅移取上层有机相至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；┅┅加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s溶解干燥残留物，再加入2ml复溶工作液（见配液5），用涡旋仪充分混合1min，3000g以上，离心5min；┅┅除去上层有机相，取下层100ml用于分析。

九、检测步骤测定前应须知：1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要。