溶原菌检测.docx

溶源性细菌的检查与鉴定细菌染色体上整合有前噬菌体（或称原噬菌体）并能正常生长繁殖而不被裂解的细菌，称为溶源性细菌溶源性细菌在自然界中普遍存在，而且自发裂解，释放温和噬菌体，但频率较低（10 -2~105）物理方法（如紫外线和高温）和化学方法（如丝裂霉素 C）可诱导大部分溶源菌裂解并释放温和噬菌体溶源性细菌对同一种或关系密切的噬菌体具有免疫性，因此对于溶源菌的检查必须有相应的敏感菌株才能确定，敏感菌株对以从待检的溶源菌株相近的种或变种或不同菌株中找到溶源性细菌裂解释放噬菌体，会给发酵工业带来威胁，溶源性细菌使宿主细胞发生溶源转变，不仅可以保护溶源菌免受同源噬菌体的再感染，还会赋予宿主细胞新的特性，温和噬菌体已被广泛用于转导、基因工程载体和分子生物学等领域本实验采用诱导方法使溶源细菌裂解. 再用敏感菌双层平板法检测诱导后噬菌体释放数目的增加，从而确认细菌的溶源性材料1.样品 待检菌——大肠杆菌 225 (λ),敏感菌——大肠杆菌 2262.培养基及药品和试剂 LB 固体、半固体和液体培养基，1%蛋白胨，100mmol/l Tris-HCL(pH7.6)缓冲液或生理盐水，氯仿，0.2% 柠檬酸钠溶液。

3、设备 水浴箱、台式离心机、紫外光灯、摇床等4、器皿及其他 试管、培养皿、三角瓶、吸管，离心管、滤膜、滤膜滤菌器等方法与步骤本实验采用紫外线处理诱导溶源菌裂解，未经诱导处理的溶源菌菌悬液做对照1.溶源菌培养 将经 LB 斜面活化的大肠杆菌 225（λ），接种于装有 20mlLB 培养液的 250ml 三角瓶内， 30℃振荡培养 16h，再从中取 2ml 菌悬液接入另装有 20ml LB培养液的 250ml 三角瓶内，37 ℃振荡培养 2h 至对数期2．排除游离噬菌体 如待检菌株为芽孢杆菌，可先制成孢子悬液，再经 80℃ 10min 处理，杀死溶源菌表面可能吸附的及游 离的噬菌体；如待检菌抹为非芽孢杆菌，可利用噬菌体制备的抗血清或 0.2%柠檬酸钠溶液洗涤对数期溶源菌细胞，除去表面吸附的及游离的噬菌体然后经 4000r/min 离心 10min，上清液可加人敏感指示菌做双层平板测定，用于检验样品中足孖钌游离的噬菌体及吸附「溶源菌表曲的噬菌体，离心后的菌体细胞进行诱导处理3.诱导溶源菌 离心后收集的菌体用无菌生理盐水洗涤两次，用生理盐水或 100mmol/l Tris-HCL 缓冲液（pH7.0）制成终浓度为 1011个/ml 细胞的菌悬液，每皿加 5ml菌悬液，经紫外灯 30W，距离 30cm、照射 30s，立即加入 5ml 双倍浓度的 LB 培养液，混匀后 37℃黑暗中培养 2h。

4，溶源性菌株检查 按双层琼脂法操作，取上述诱导裂解液加入几滴氯仿，以 10 倍稀释法适当稀释，选择后 3 个稀释度的稀释液，毎个稀释液取 0.3ml 与 0.2ml 对数期敏感大肠杆菌 226 菌悬液混匀，再加入融化后冷却至 45℃的 LB 半体培养基，立即混匀，随即倾入 LB 固体培养基平板上，待凝固后，37 ℃培养 6h 观察经过培养的平板如果有大量噬菌斑出现就证明被检菌株是溶源菌。