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162 例喉癌患者中高危型 HPV(16/18 型)的基因分析作者：彭郑坚，耿建祥，周伟，付雪东【关键词】 喉鳞状细胞癌;HPV;高危型; 原位杂交高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virrus，HPV)是引起人类宫颈癌的主要原因，也是已知目前唯一明确引发人类恶性肿瘤诱因的病毒根据 HPV 嗜鳞状上皮的特征，笔者采用原位杂交 HPV基因检测技术对喉部鳞状细胞癌进行检测，分析高危型(16/18 型)HPV 表达与喉部鳞癌的关系，以探讨其临床意义1 材料与方法1.1 标本来源 本组 62 例病例选取南京中医药大学第三附属医院病理科，安徽省马鞍山市第一人民医院病理科及安徽省滁州市第一人民医院病理科 2004 年 4 月—2008 年 10 月间手术切除的喉癌标 62 例，均为男性病例年龄 43～82 岁，平均 65 岁所有病例术前均未行放疗和化疗，术后经病理证实62 例喉癌中，高分化癌 24 例，中分化癌 17 例，低分化癌 21 例;声门上型 27 例，声门型 35 例; 临床Ⅰ期 21 例，Ⅱ期 23 例，Ⅲ期 12 例，Ⅳ期 6 例;有淋2巴结转移 21 例，无颈淋巴结转移 41 例。

1.2 检测方法 62 例喉癌及 15 例喉部正常的鳞状上皮组织(为对照标本) ，标本均 10%的福尔马林固定，石蜡包埋，4μm 切片，常规 HE 染色外，行原位杂交 HPV(16/18 型)DNA 检测用地高辛记 HPV(16/18 型) 探针，按照福建泰普生物科学有限公司试剂盒说明书进行标记，经过 HPV 病毒 DNA 变性，靶序列特异杂交，经信号放大、显色后，镜下观察结果阳性信号在光镜下见喉鳞状细胞癌胞核呈棕褐色着色，胞浆呈小点状棕褐色着色(图 1，2) ，阴性对照，鳞状细胞核和浆不显色2 结果HPV(16/18 型)在 62 例喉鳞癌组织中呈核阳性表达率为72.6%(45/62)，其中高拷贝表达的 15 例，中拷贝表达的 22 例，低拷贝表达的 8 例，不表达的 17 例，胞浆表达率为 95.2%(59/62)，其中高拷贝表达 12 例，中拷贝表达 19 例，低拷贝表达 28 例，不表达的 3 例，15 例喉部正常鳞状上皮组织仅 1 例细胞核和 1 例细胞浆呈阳性表达应用统计软件包 SPSS 13.0 处理，原位杂交HPV(16/18 型) 的阳性表达与喉癌的分型、分期、病理分化程度及颈淋巴转移均无相关性(P>0.05)，喉鳞癌组织中(16/18 型)的阳性表达与喉部正常鳞状上皮组织中的阳性表达差异有显著性3(P<0.05)，提示 HPV(16/18 型)感染与喉鳞癌发生有相关性，差异有显著性(P<0.05)(图 1，2)。

3 讨论喉癌一般指喉鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)，它占全身癌肿的 1.2%～1.6% ，占男性所有肿瘤的 2.2%，女性的0.4%，每年死亡率为 4～10/10 000，几乎所有喉癌都是鳞状上皮癌，多数患者为 40 岁以上，通常发病高峰在 55～65 岁年龄段，也有较年轻患者的报道，大约 96%的患者为男性吸烟是危险因素之一，同时伴酗酒者危险性更高喉癌发病有明显的地域性声嘶是声带癌常见的早期症状HPV 在喉癌中的致癌作用，特别是HPV16 型和 18 型，被认为是与喉癌发生密切相关的高危型，提示高危的型的感染是喉癌发病学中不容忽视的致病因子喉癌患者发生第二种上呼吸道、上消化道或肺肿瘤的危险性增加这可能与共同的致病因子 HPV 有关，尤其是高危型 HPV 在上述腔道中的感染有关[1～8]喉鳞癌的发生与多种危险因素有关，如性别、年龄、长期吸烟、酗酒等最近的研究表明 HPV 感染可能是另一种独立的危险因素HPV 在喉鳞癌中的致癌作用，已是目前喉鳞癌病毒病因学研究的重要内容之一，尤其是高危型 HPV 感染被认为与喉鳞癌的发生、4发展密切相关喉鳞癌之所以大都发生于鳞状上皮覆盖的声门和会厌部，可能与这些部位缺乏纤毛运动，致癌物质(病毒、化学及物理致癌因子)易于在此停滞有关[9] 。

分子遗传学特征：喉癌组织中有 P53 高表达可能与 P53 突变相关，但在多数病例为野生型 P53、P16 缺失常见(约见于 90%的病例)，可能为肿瘤早期的分子事件[8] 乳头瘤病毒属乳头瘤病毒科，是一类特异感染人类上皮、黏膜的微小共价双链环状 DNA 病毒1949 年 Straus 等首先在电镜下从普通疣体浸出液中观察到 HPV 颗粒以来，至今已发现约 200多种人乳头瘤病毒其长约 8.0kb(碱基对) ，分子量为 5×106，沉降系数 40，在电镜下观察该病毒为球型、无包膜、表面有 72 个壳微粒，直径 45～55nm[9]HPV 可广泛分布于人和动物中，一般认为其高危型病毒致癌，也有低危型致癌的报道目前有 20 多种致癌的高危型，其中 13 种高危型 HPV 较为常见，而 16、18 型 HPV 约占致癌型别的 70%左右自 1976 年有学者提出人乳头状瘤病毒(HPV)是致癌因子以来，大量的研究表明高危型 HPV16、18 型与喉鳞癌有直接关系[9]HPV 在喉癌的发生、发展中起重要作用，在与高危型 HPV相关的恶性肿瘤中，HPVDNA 基因组以整合形式为主绝大多数表5现为整合和游离两种形式共存，单纯以游离形式存在的为少数，这可能与致癌途径不同有关。

研究表明 HPV16 型常整合到宿主细胞染色体中，这些整合不是随机的，HPV16 型可整合到宿主细胞染色体 3p14.2 位点，而这恰好在抑癌基因 FH1T(fragile histidine triad)基因内由于病毒基因组发生断裂点在病毒 E1/E2 基因区，使得此区两个病毒基因丢失，其下游区域 E6/E7 基因完整地接到病毒上游调节区的启动子和增强子序列，使 E6/E7 在喉鳞癌中得以持续过量表达，导致细胞癌性转化[9]喉癌以鳞状细胞癌(SCC)为主，烟草和酒精是最重要的致病危险因素然而，越来越多的证据表明，人乳头瘤病毒(HPV)是引起头颈部某些 SCC 的原因约 75%的头颈部 SCC 与吸烟、饮酒有关，并呈倍增联合效应HPV 是最新鉴定的一种头颈部 SCC 致癌因子，以 HPV16 型为主，HPV18 型次之利用原位杂交和 p16 免疫组化技术可检出致癌性 HPV 型别[10] HPV 与头颈部 SCC 之间的相关性也体现在肿瘤的预防，治疗及预后方面HPV 阳性是头颈部 SCC 的良性预后因子与 HPV阴性肿瘤相比，HPV 阳性肿瘤对放疗和( 或) 化疗都具有较好的反应性，对肿瘤特异性抗原的免疫监视亦可能更为敏感。

因此，HPV 的感染状态是一种重要的预测指标，在设计头颈部 SCC 前瞻性临床研究时应予以考虑比如，我们对 HPV 阳性局部晚期头颈部 SCC 患6者实施标准治疗时可能会取得良好的效果，但强化治疗反而可能毫无益处目前，针对 HPV 的疫苗接种已在预防宫颈癌上初见成效，而此疫苗在头颈部 SCC 的预防上也具有一定的益处[10]由此可见，对头颈部 SCC 进行 HPV 检测不但有利于预防，更有利于治疗及预后的判断由于原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，而且不需要从细胞中提取核酸，对组织中含量低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态[7]因此，原位杂交是诊断及研究 HPV 感染的一项非常重要的技术本文 HPV(16/18 型) 在 62 例喉鳞癌组织中呈核阳性表达率为72.6%(45/62)，胞浆表达率为 95.2%(59/62)，提示喉鳞癌的发生、发展与 HPV(16/18 型)感染存在着相关性总之，高危型 HPV 与喉鳞癌密切相关，HPV 的检测对喉鳞癌的预防，治疗及预后方面具有重要指导的意义。

首先，要尽快在全国各地开展和普及 HPV 知识及技术，其次，对高危型 HPV 进行中医药干预治疗，切断其致癌途径，配以病理检查，使喉鳞癌的早期发现，预防和控制成为可能本文图片见封三)7【参考文献】1 邱杰，张文伟.人乳头状瘤病毒与喉癌.肿癌防治研究，2006，33 ： 610 612.2 Munger K，Baldwin A，Edwards KM，et al.Mechanisms of human papillomavirus induced oncogenesis.Journal of Virology，2004，78：11451 11460.3 Yoshinouchi M，Hongo A，Nakamura K，et al.Analysis by multiplex PCR of the physical status of human papillomavirus type 16 DNA in cervical cancers.J Clin Microbiol， 1999，37：3514 3517.4 罗荣城，韩焕兴.肿瘤综合诊疗新进展，第 2 版.北京：人民军医出版社，2006，56.5 任香善，林贞花，吴群英，等.子宫颈癌△Np63 蛋白表达的临床病理学意义.临床与实验病理学杂志，2006，22：646 648.6 赵舒薇，叶青，陆书昌，等. 人喉癌组织中人乳头状瘤病毒DNA 的检测 .中华实验和临床病毒学杂志，1999，13：13 17.87 符征，况光仪，林杰，等.原位杂交检测喉癌组织中 p53 mRNA 表达 .中国耳鼻咽喉头颈外科杂志，2004 ，11 ：346.8 Rasai J.回允中 (主译).阿克曼外科病理学(上卷)，第 9 版. 北京：北京大学医学出版社，2005，341 344.9 耿建祥，王旭波.人乳头瘤病毒检测及其临床应用.北京：人民卫生出版社，2009，68 81.10 Argiris A，Karamouzis MV，Raben D，et al.Head and neck cancer.Lancet，2008，371：1695 1709。