临检实验设计.docx

Hb 测定一、技术背景测定方法有：①HiCN 测定法 ②SDS-HB 测定法③HiN 3 测定法④AHD 575 测定法 ⑤CTAB 测定法WHO 推荐参考方法： HiCN 测定法原因：操作简单，反应迅速；所用转化液稳定易保存；可检测除 SHb 外的所有Hb；HiCN 参考品可长期保存，便于质控二、实验原理血液经氰化高铁血红蛋白转化液稀释后，红细胞被破坏，释放出血红蛋白，除SH 外，其余血红蛋白被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白（Hi） ，Hi 与 CN－ 结合生成稳定的棕红色复合物氰化高铁血红蛋白（HiCN） HiCN 在 540nm 处有吸收峰，用分光光度计测定该处的吸光度，再换算成每升血液中的血红蛋白浓度，或用 HiCN 参考液进行比色法测定制作标准曲线供查阅三、器材、试剂选择器材：（1） 、采血针、微量吸管、75%乙醇棉球及碘液、乳胶吸头（2）试剂、试管架（3）5ml 吸管、吸耳球（4）分光光度计试剂：（1）HiCN 转化液（文齐氏液）：氰化钾 0.050g，高铁氰化钾 0.20g，无水磷酸二氢钾 0.140g，Triton X-100（非离子表面活性剂）1.0ml，加蒸馏水至1000ml，调节 pH 值至 7.0—7.4。

棕色玻璃瓶试剂避光保存2）标准品：100g/l 血红蛋白四、标本EDTA-K2 抗凝静脉血或毛细血管血五、实验步骤直接定量测定法1、 加转化液：用吸管吸取 HiCN 转化液 5ml 加入试管内2、采血与转化：采集毛细血管或者静脉血 20ul，加入转化液中，封闭试管口后颠倒混匀，室温下放置 5 分钟，使 Hb 全部转化为 HiCN3、测定吸光度：在分光光度计上，使用 540nm 波长，以 HiCN 转化液或蒸馏水为空白调零后，测定标本的吸光度值（A） 4、计算 Hb（g/l）=（A 测 ×100g/l）/A 100A 测 为 540nm 处测定的标本吸光度，A 100 为标准品在 540nm 处测定的吸光度5、报告方式：XXg/l6、参考区间 成年：男性 120—160g/l，女性 110—150g/l新生儿：170—200g/l六、临床意义通过红细胞计数、血红蛋白测定及血细胞比容测定即可确定贫血的存在程度血红蛋白增多有以下情况：(1)生理性增多：见于高原居民胎儿和新生儿，剧烈活动、恐惧冷水浴等；(2)病理性增多：见于严重的先天性及后天性心肺疾患和 血管畸形如 法洛四联症、 发绀型 先天性心脏病、阻塞性肺气肿、肺源性心脏病、肺动脉或肺静脉瘘及携氧能力低的 异常血红蛋白病等；也见于某些肿瘤或肾脏疾病，如肾癌肝细胞癌、肾胚胎瘤及 肾盂积水、多囊肾等。

血红蛋白减少见于以下情况：(1)生理性减少：3 个月的婴儿至 15 岁以前的儿童主要因 生长发育迅速而致的造血系统造血的相对不足，一般可较正常人的低 10%-20%妊娠中期和后期由于妊娠血容量增加而使血液被稀释老年人由于骨髓 造血功能逐渐降低，可导致红细胞和血红蛋白含量减少2)病理性减少：A.骨髓 造血功能衰竭如再生障碍性贫血、骨髓纤维化所伴发的贫血B.因造血物质缺乏或利用障碍所致的贫血如缺铁性贫血、叶酸及维生素 B12 缺乏所致的 巨幼细胞性贫血C.因红细胞膜酶遗传性的缺陷或外来因素所致红细胞破坏过多而导致的贫血，如 遗传性球形红细胞增多症、海洋性贫血 阵发性睡眠性血红蛋白尿、 异常血红蛋白病、 免疫性溶血性贫血心脏体外循环的大手术或某些生物性和化学性等因素所致的溶血性贫血以及某些急性或慢性失血所致的贫血七、质控1、标本：血红蛋白检测原理是比色法，引起血清浊度增大的因素常致血红蛋白浓度假性增高，如高脂血症、高球蛋白、高白细胞（WBC＞30×10 9/L） 、HbCO增多及高血小板（Plt＞700×10 9/L）等2、器材及试剂：定期校准分光光度计，分光光度计的波长和光程必须准确、灵敏度高、线性好、无杂光，否则会影响结果准确性。

选用合格的微量采血管、刻度吸管及比色杯保证试剂的质量3、技术操作：消毒、采血、稀释、混匀等应合格确保 HbCO 完全转化，可延长转化时间或加大试剂中高铁氰化钾的用量4、废弃物处理：HiCN 转化液中 KCN 是剧毒品，配制转化液时要按剧毒品管理程序操作为防止 KCN 污染环境，比色测定后的废液应妥善处理八、注意事项1、试剂保存：试剂保存于棕色瓶内，不得使用塑料试剂瓶可以冷藏保存，但不能冷冻，防止因丢失 CN-而导致血红蛋白转化不完全2、做好安全防护3、分光光度计校正4、消除异常标本的干扰：白细胞过多引起的浑浊，可离心后取上清液比色球蛋白异常增高引起的浑浊，可改用高氯化钠的转化液后重新测定九、方法学评价优点：操作简单，反应迅速；所用转化液稳定易保存；可检测除 SHb 外的所有Hb；HiCN 参考品可长期保存，便于质控缺点：KCN 试剂有剧毒；不能测定 SHb；对 HbCO 反应较慢；遇高白细胞和高球蛋白血症的血标本会出现浑浊 PLT 分类计数1、混悬液滴入计数池后应静置 15min ,带血小板完全下沉时才能计数，试验背景分析：1.PLT 的产生：骨髓干细胞☞多功能祖细胞☞巨核祖细胞☞幼巨核细胞☞巨核细胞☞巨核细胞胞质块脱落☞血小板；2.PLT 的功能：（1）促进止血和加速凝血 （2）维持毛细血管壁完整性；3.目前监测血小板的的方法有仪器法和手工法，仪器法有逐渐代替手工法的趋势，但仪器法有很多干扰因素，导致结果不可靠，特别是低浓度的血小板，按照复检规则，需用手工法复检出报告。

本实验设计采用手工法进行血小板计数；二、实验原理：血液经血小板稀释液稀释后，红细胞被溶解，注入计数池后，在显微镜直接计数（普通光学显微镜计数法和相差显微镜计数法）计数血小板经换算求出每升血液中的血小板三、器材、试剂选择:1.器材：（1）普通光学显微镜、改良牛鲍计数板、专用血盖片（2）试管、1.0ml 刻度吸管、洗耳球、一次性 20 微升微量吸管、乳胶吸头、一次性采血针、（3）医用棉签、优质卫生纸2.试剂选择：（1）草酸铵稀释液：常用，破换红细胞能力强，血小板形态清晰，血小板常规计数法首选稀释液；（2）复方尿素稀释液：稀释后血小板肿大易辨认，但尿素易分解并且不能完全破坏红细胞；（3）高铁氰化钾稀释液：试剂稳定，易于长期保存，不能完全破坏红细胞;（4）复方碘稀释液：不破坏红细胞，试剂易长菌，干扰计数，此法已被淘汰；五、实验步骤：1.取小试管一支，加入血小板稀释液 0.38ml；2.标本采集：严格按照标准采血规程采集患者肘静脉血液（EDTA 抗凝管或者直接进行指尖采血；3.稀释血液：用棉球或者卫生纸擦去微量吸管管外的余血，将其插入稀释液底部，缓缓放出血液，在吸取上层稀释液吸洗微量吸管 2-3 次，轻轻混匀细胞悬夜约 1min，室温下静置 10min 左右；4.充池：轻微振荡试管，将细胞悬液充分混匀，用微量吸管吸取细胞悬液 15 微升左右，冲入清洁而干燥的计数室内，静置 10-15min,袋血小板完全下沉到计数池底面时，于显微镜下进行计数；5.计数：以低倍物镜找到计数板的中央大方格后，改用高倍镜，在大方格内计数 4 角和中央五个中方格的血小板数。

六、数据记录：五个中方格的血小板数N₁ N₂ N₃ N5 N5七、结果计算：血小板计数（/L)5 个中方格内计得的血小板数（N)×5×20×10×106＝10×10 9/La.5 表示无个中方格内的血小板数换算成一个大方格（0.1μl)稀释后血液中血小板数；b.表示 0.1μl 血小板数换算成 1μl 稀释后血液中的血小板数；c.表示血小板的稀释倍数d.106表示将微升换算为 L 的系数七、结果报告：血小板：XXX×10 9/L参考区间：100-300×10 9/L8、临床意义：1.生理性改变：（1）增多：见于午后、冬季、和高原居民、月经后、妊娠中晚期运动、饱餐后静脉血；（2）减少：见于早晨、春季、平原居民、月经前、分娩后、休息后、毛细血管血2.病理性改变：（1）.血小板减少：急性白血病，系统性红斑狼疮，DIC，脾肿大，新生儿血小板减少症a.20-50×109/L，可有轻度出血或手术出血；b.＜20×10 9/L，可有较严重的出血；c.＜5×10 9/L，可导致严重出血；（2）血小板增多：慢性粒细胞白血病，急性化脓性感染，大出血，外科手术，脾切除等；a.＞400×10 9/L，为血小板增多；b.＞1000×10 9/L，常有血栓形成的危险。

9、质量控制：（1）稀释液放室温使用，但应密闭以防灰尘及水分蒸发，最好放冰箱保存为妥；（2）采血时，如果同时做 WBC 等，应先采血做血小板；（3）悬夜制备，充分混匀，摇动标本 2min 或 200 次以上;（4）计数光线不可太强，1h 内技术完成，如红细胞不完全溶解，影响血小板计数时，可加大稀释倍数，或另换稀释液10、注意事项：（1）检查前，患者应避免服用含有阿司匹林及其他抗血小板药物;（2）所用全部器材必须校准、洁净、干燥;（3）使用符合要求的优质血小板稀释液(优质血小板稀释液应具备以下条件：a.能有效阻止凝血；b.很快将血小板凝固，防止血小板聚集和形态改变；c.溶血要求红细胞破坏完全；d.组成简单，易于保存，不生长细菌；e.血小板稀释液空白计数值应为零;(4)采血时，刺针深度要足够，使血液流畅，避免用力挤压拭去第一滴血后立即采血采血，以防止血小板聚集和破坏；(5)血液离体后更易发生聚集，所以各操作步骤均应迅速而适度；注意在充池前应充分摇匀;（6）血小板小而轻，在液体中下沉很慢，血小板红细胞形态观察一、实验原理：外周血制备血涂片并经瑞士染色后，血中各种细胞由于化学成分和性质的不同以及对染料的亲和作用和吸附作用的差异，而呈现出不同的形态和染色特点，红细胞红细胞在大小、形态、染色性和结构等方面均与其他细胞存在差异，同时红细胞在病理情况下可出现相应特征性的异常变化，据此可在光学显微镜下观察正常红细胞形态，并识别异常红细胞的形态变化。

二、器材与试剂：1、显微镜2、香柏油、二甲苯三、标本：制备良好的瑞士染色血涂片四、实验步骤：1、采静脉血或指端血一定量2、用取出的一滴新鲜血均匀的涂在玻片上，制成血膜涂片3、对血涂片进行瑞士染色4、低倍镜观察：低倍镜下观察血涂片中红细胞染色和分布情况，浏览全片看是否存在异常细胞5、低倍镜下选择细胞染色良好、分布均匀（红细胞紧密排列但不重复）区域，一般选血涂片体位交界处6、油镜观察：在血涂片选定区域滴加香柏油，油镜下仔细观察红细胞形态7、观察完毕后，清洁显微镜镜头和血涂片8、报告方式：描述标本中正常红细胞形态特点和异常红细胞形态变化异常红细胞形态变化主要包括大小异常、形态异常、血红蛋白含量异常、排列和结构异常等五、参考区间正常成熟红细胞呈双凹圆盘状，细胞间形态相似，大小均一性好，瑞士染色呈淡红色，中央 1/3 为生理性淡染区，胞内无异常结构偶见变形或破碎细胞，分布极为局限六、质量控制1、有合格的血液细胞形态检验人员2、选择细胞分布均匀区域进行镜检3、注意完整规范的检查顺序：应先在低倍镜下检查血涂片，观察细胞分布和染色情况，再用油镜观察血膜体位交界处的细胞形态，同时浏览是否存在其他异常细胞。

4、减少人为因素影响：①抗凝剂浓度过高或血标本久置 ②载玻片上有脂类物质 ③ 血涂片制备不当 ④ 血涂片干燥过度或固定液中混油水分 ⑤染色不当 七、临床意义：1、小红细胞：r10μm，染多色性或含有嗜碱性点彩，巨幼贫，溶血性贫血，恶性贫血3、巨红细胞：r>15μm,缺乏叶酸几维生素 B12 巨幼贫4、红细胞大小不均：直径相差一倍以上，严重的增生性贫血，巨幼贫最为明显5、正色素性红细胞：淡红色圆盘状，中央有生理性淡染区正常人、急性失血、再障、白血病6、高色素性红细胞：巨幼贫7、低色素性细胞：缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血8、多色性红细胞：溶血性贫血、失血性贫血9、血细胞内结构异常：嗜碱性点彩红细胞见于部。