各种酶活性测定方法（2022年整理）.pdf

抗坏血酸过氧化物酶（抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定）活性的测定 过氧化氢酶（过氧化氢酶（CAT）活性测定）活性测定 过氧化物酶（过氧化物酶（POD）测定方法）测定方法 超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD）活性测定）活性测定 小组第一次讨论结果： 一、抗坏血酸过氧化物酶（一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定）活性的测定 1.原理原理 APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关 2.所用方法所用方法 （1）采用碘液滴定法: 称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。

每个处理设3 个重复 （2）紫外吸收法： 称取 1g 芥蓝叶片组织，加入 1.6 mL 预冷的磷酸缓冲液（PBS-K） （pH 7.8）提取液（含 1 mmol L-1 AsA，3 mmol L-1-巯基乙醇，0.5 mmol L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA） 用液氮研磨，提取液于 4，12000 g 离心 20 min，上清液用于酶活性的测定取 0.10 ml 酶液（可视情况调整） ，加入 1.70 ml 含 0.1 mM EDTA-Na2的 PBS（0.05 mol/L，pH7.0） ，再加入 0.10 ml 5 mM 的 AsA，最后加入 0.10 ml 20mM H2O2，立即在 20下测定 D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内 AsA 减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零） APX 总活性(uM g-1 min-1) = OD Vr/ (A d Vt W t) OD：反应时间内吸光度的变化； t：反应时间，min； Vr：提取液体积，mL； A：消光系数，2.8mM-1cm-1； d：比色杯厚度，1cm； Vt：测定液体积，mL； W：样品鲜重，g。

二、二、 过氧化氢酶（过氧化氢酶（CAT）活性测定）活性测定 1.原理原理 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白，含有铁，能够催化过氧化氢分解为水和氧分子，此过程中起传递电子的作用，过氧化氢既是氧化剂又是还原剂，因此可根据 H2O2的消耗量或 O2的生成量测定该酶活力大小 在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢即可求出消耗的 H2O2的量 2.CAT 活性测定方法活性测定方法 碘化钾滴定法： 本方法利用 H2O2能将 KI 中的 I-氧化， 生成 I2， 以淀粉作为滴定终点指示剂，用硫代硫酸钠滴定，计算出生成 I2的量，再换算所消耗 H2O2的量取 100ml 三角瓶 6 个，编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液 10ml 立即向 4、5、6 号瓶中各加入 3.6ml/L 硫酸 5ml 以终止反应作为空白测定然后将各瓶放在 20 错误错误!未找未找到引用源到引用源水浴中保温，待瓶内温度达到 20 错误错误!未找到引用源未找到引用源时，并向各瓶准确加入 5ml0.1mol/LH2O2摇匀，记录时间5min 后再依次向 1、2、3 号瓶中各加入 3.6mol/L 硫酸 5ml 终止酶促反应，然后向每瓶各加 20%碘化钾 1ml，3 滴钼酸铵及 5 滴淀粉指示剂。

用 0.02mol/L 硫代硫酸钠滴定至蓝色消失 过氧化氢酶活性=错误错误!未找到引用源未找到引用源 A：空白值滴定值（ml） B：样品滴定值（ml） C：Na2S2O2浓度（mmol/L） a：测定时酶液用量（ml） V：酶液总体积 W：样品重（g） t：反应时间（min） 17:1/2H2O2的摩尔质量（mg） 2.紫外吸收法： H2O2 在 240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低测量吸光率的变化即可测出过氧化氢酶的活性 试管号 S1 S2 S3 提取液（ml） 0.4 0.4 0.4 失活酶液 缓冲液（ml） 3.0 3.0 3.0 蒸馏水（ml） 2.0 2.0 2.0 25预热后,逐管加入 0.3ml 0.1mol/L 的 H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入比色杯中，240nm 下测定吸光度，每隔 1min 读数 1 次，共测 4min，待 3 支管全部测定完后，计算以 1min 内 A240 减少 0.1 的酶量为 1 个酶活单位(u)过氧 化 氢 酶 活 性 u/(g min)= A240 VT/(0.1V1 t W) 。

其 中 A240 = AS3- (AS1-AS2)/2； AS1、AS2 样品管吸光值； AS3 加入失活酶液的对照管吸光值； VT 粗酶提取液总体积(ml)； V1 测定用粗酶液体积(ml)； W 样品鲜重(g)； 0.1是 A240 每下降 0.1 为 1 个酶活单位(u)； t 加过氧化氢到最后一次读数时间(min) 三、过氧化物酶（三、过氧化物酶（POD）测定方法）测定方法 1.原理原理 过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化， 生成茶褐色物质， 可用分光光度计测量生成物的含量 2.POD活性测定方法活性测定方法 比色法： 称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r min 离心 10 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次， 上清液并入容量瓶中， 定容至刻度， 贮于低温下备用 2 、 取光径 1 cm 比色杯 2 只， 于 1 只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （如酶活性过高可稀释之） ， 立即开启秒表记录时间， 于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。

3、结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 A 470 /min g （鲜重） 表示之也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示 过氧化物酶活性 u/ （ g min ） A470为反应时间内吸光值的变化； W为所称样品重，g； t为反应时间，min； VT为提取酶液总体积，ml； VS为测定时取用酶液体积，ml 四、四、超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）0.05mol/L 磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A 母液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液: 取 Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g； B 母液：0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g 分别用蒸馏水定容到 1000ml 0.05mol/L PBS （pH7.8） 的配制： 分别取 A 母液(Na2HPO4) 228.75ml，B 母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至 1000ml。

参考文献：参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267268 （2） 14.5mM甲硫氨酸溶液： 取2.1637g Met用磷酸缓冲液 （pH7.8）定容至 1000ml （3）30M EDTA-Na2溶液：取 0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至 100ml （4）60M 核黄素溶液：取 0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至 100ml，避光保存 （5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取 0.1840g NBT 用 PBS 定容至 100ml，避光保存 酶液制备：取 0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 1.6ml 50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH7.8） 在冰浴上研磨成匀浆， 转入离心管中在 4、 12000r / min 离心 20min，上清液即为酶液 2、酶活性测定 （1）反应混合液配制：分别取 Met 溶液 162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液 5.4ml，NBT 溶液 6ml，核黄素溶液 6ml,混合后摇匀； （2）分别取 3ml 反应混合液和 30l 酶液于试管中 （3）将试管置于光照培养箱中在 4000 lux 光照下反应 20min； 同时做两支对照管，其中 1 支试管取 3ml 反应混合液加入 30l PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另 1 支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测 OD560(出现颜色即可测定) （5）酶活性计算：SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原 50所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为 1 个酶活单位（u） SOD 总活性 ( Ack-AE )V/（1/2AckWVt） SOD 比活力SOD 总活性/蛋白质含量 SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW） ；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V 为样品液总体积（ml,1.6ml，加入 PBS 的体积)；Vt 为测定时的酶液用量（ml，30ul） ；W 为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量 mg） ；蛋白质含量单位为 mg/g。