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    聚焦PCR技术应用突破考试难点    唐建烽Summary PCR技术是现代生物学研究中常涉及的重要技术，也是高中生物教学的重点和难点由于高中实验室条件限制，学生缺少实操演习，学习难度大，考试得分率低通过对考试题目中常见的PCR应用类型进行总结和梳理，希望帮助学生突破学习难点，起到举一反三的作用Key PCR 应用 基因工程 高中生物G633.91文献标志码 BPCR是一种以特定靶DNA片段为模板，以目的基因特异性碱基序列设计的引物为起点，在耐高温DNA聚合酶催化下，通过反复的高温变性、低温退火、中温延伸等步骤，快速、特异性地体外复制出目的DNA片段的技术自PCR发明以来，科研人员在此基础上进行了大量改进，开发了适用于不同生物学研究目的的PCR技术，如反向PCR、不对称PCR、实时PCR、数字PCR技术由于PCR具有敏感、特异、快速、简便等优点，被广泛应用于食品安全检测、疾病检验、遗传病诊断、基因进化研究等领域，对分子生物学的发展产生了深刻影响在以“真科学考查真素养”为背景下的高考试题中，试题内容多选用前沿科技成果作为素材进行命制，以真实的科研研究创建真实的科学探究情景和研究任务。

PCR作为现代分子生物学常用的技术，高考试题经常涉及对PCR技术应用的考查，且考查方法多种多样1基因工程操作程序中的应用这类知识考查的原型是《选择性必修3·生物技术与工程》中有关基因工程基本操作程序的相关知识PCR技术可用于获取和扩增目的基因、增添酶切位点、检测目的基因是否正向连接等1.1获取和扩增目的基因科学家常用PCR特异性地快速扩增目的基因RT-PCR是从mRNA获得cDNA并进行扩增的一种实验技术该技术通常需要提取总RNA，以其中mRNA为模板在逆转录酶的作用下合成cDNA，再以cDNA为模板，以目的基因特异性碱基序列设计引物，进行PCR扩增，即可获得大量目的基因例1】乳头瘤病毒（HPV）是一种DNA病毒可导致人患宫颈癌科研人员将HPV某外壳蛋白A基因构建成表达载体，经包装或直接注入体内，表达出相应抗原，诱导机体产生免疫反应该方法获得的疫苗称为DNA疫苗获取A基因的方法：从宿主细胞中提取总RNA，以与互补的一段单链DNA作为引物，加入逆转录酶获得，然后经PCR扩增获得大量的A基因参考答案：A基因转录出的mRNA;cDNA1.2增加酶切位点在构建基因表达载体时，为使目的基因和载体产生相同的末端以便于拼接，需要用同种限制酶切处理二者。

实际操作中往往会出现目的基因两侧没有合适的酶切位点，为解决该问题可以在PCR扩增目的基因时，在引物的5′端添加合适的碱基序列从而增加酶切位点例2】（2020·海淀一模）研究人员选取启动子sul准备与图1表达载体连接图2显示了启动子sul内部存在的酶切位点，箭头表示转录方向依据图1，克隆启动子sul时，在其A端和B端应分别添加限制性内切酶的酶切位点，从而确保启动子sul可与已被酶切的表达载体正确连接解析：在选择酶切位点时需要注意不能破坏启动子、目的基因、终止子和标记基因等结构，此外还要注意连接方向，从而保证目的基因的正常表达由于启动子中含有SmaI和HindIII，因此只能选择SapI和XhoI由于转录方向为A到B，因此在A端添加XhoI，在B端添加SapI参考答案：XhoI和SapI1.3目的基因是否正向连接【例3】（2019·江苏卷）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定图3所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是某学生尝试用图3中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是解析：根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR扩增时选择的一对引物要位于目的基因的上游和下游，因此只能选择甲丙或者乙丙組合。

若选择甲丙组合，无论目的基因是否正确连接，扩增的片段都是450bp，不符合要求;若选择乙丙组合，正向连接可扩增的片段为350bp，若反向连接，因为引物位于一侧，则不可以扩增根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段（等于300bp+100bp），说明选择的是引物甲和乙，且乙引物应该位于重组质粒的外侧，目的基因发生了反向连接参考答案：乙、丙;目的基因反向连接1.4目的基因的检测与鉴定目的基因在受体细胞中稳定维持和表达其遗传特性，是转基因成功的重要一步可以通过PCR技术检测目的基因是否导入受体细胞以及检测目的基因是否转录出mRNA例4】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到图4所示的电泳图谱其中1号为DNA标准样液，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图4所示据此作出的分析，不合理的是（）A.PCR产物的分子大小在250～500bp之间B.3号样品为不含目的的基因的载体DNAC.9号样品对应植株不是所需的转基因植株D.10号确定反应体系等对结果没有干扰解析：PCR技术是基因工程中常用的检测目的基因是否导入受体细胞的方法提取受体细胞的总DNA，以载体为模板进行PCR，之后再进行电泳检测。

在设计PCR引物时，最好一个引物与载体DNA互补结合，另一个引物与目的基因DNA互补结合，并以重组DNA为模板才可获得扩增产物由图可知，3～8号有扩增条带，分子大小在400bp左右，3号作为参照，应为不含目的的基因的载体DNA因9号PCR结果无扩增条带，所以不是所需转基因植株参考答案：B例5】（2017·石景山一模）DNA拓扑异构酶II在肿瘤细胞中含量明显高于正常细胞华蟾素注射液处理HepG-2细胞48h后：提取HepG-2细胞中的总RNA，经逆转录形成cDNA，PCR扩增并进行电泳图5所示电泳条带的宽窄代表解析：由于mRNA在组织细胞中的含量很低不易检测且不可以直接扩增，因此需要将mRNA逆转录成cDNA再进行扩增，通过cDNA的扩增量间接反映目的基因的转录水平参考答案：TopoII基因转录水平2检测突变体基因型土壤农杆菌的质粒上有一段特殊的DNA区段，在侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上这一段能转移的DNA叫做T-DNA科学家常利用T-DNA这一特性，用于植物基因功能研究及植物突变体的培育若明确知道T-DNA插入的位点，可根据插入位点基因及T-DNA特异性核苷酸序列设计引物进行PCR;再进行凝胶电泳，根据电泳条带的差异即可判断基因型是纯合子还是杂合子。

例6】（2015·海淀一模）为验证F2植株基因型及比例，研究者根据D基因、T-DNA的序列，设计了3种引物，如图6所示随机选取F2植株若干，提取各植株的总DNA，分别用引物“I+III”组合及“II+III”组合进行PCR（完整的T-DNA过大，不能完成PCR），检测是否扩增若，则相应植株的基因型为Dd;同理可判断其他基因型，进而统计各基因型比例解析：由图可知，引物II和III分为与D基因的两侧的碱基序列互补，引物I与T-DNA上面的单链碱基互补由于完整的T-DNA过大，不能完成PCR，D基因只能通过引物“II+III”组合进行PCR扩增，d基因只能通过若引物“I+III”组合进行PCR扩增因此，若仅引物“II+III”组合可以扩增，则相应植株的基因型为DD;若仅引物“I+III”组合可以扩增，则相应植株的基因型为dd;若引物“I+III”组合及“II+III”组合都可以扩增，则相应植株的基因型为Dd参考答案：引物“I+III”组合及“II+III”组合均可以扩增3诱导基因突变在PCR过程时，通过设计碱基错配的引物，可以实现对目的基因的定点突变，也可以通过替换基因片段的方式实现基因的突变，从而实现对基因功能的研究。

例7】（2018·海淀区高三期中）检测发现，转入的蛋白A基因在大肠杆菌细胞中表达效率很低，研究者推测不同生物对密码子具有不同的偏好，因而设计了与蛋白A基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基），并按图7所示方式依次进行4次PCR扩增，以得到新的蛋白A基因图7所示的4次PCR应该分别如何选择图中所示的引物？请填写表1（若选用该引物划“√”，若不选用该引物则划“×”）解析：由题目可知，该方法的主要原理是根据实验目的要求设计碱基错配的引物B和C以蛋白A基因为模板，引物A和B构建PCR反应体系1以引物C和D构建PCR反应体系2将PCR反应产出物1和2混合后构建PCR反应体系3，由于引物B和C碱基序列互补，所以两个PCR产物会连接在一起在DNA聚合酶的作用下两条单链会沿着5′到3′的方向延伸，从而得到等长的PCR产物3再以PCR产物3为模板加入引物A和D，构建PCR反应体系4经过PCR扩增后即可得到实现定点突变的基因片段4疾病、食品安全的检测实时定量PCR是一种检测样品中特定核酸含量的PCR反应一般使用带有荧光标记的引物，随着PCR反应的进行，荧光信号强度也按照特定的规律随PCR产物不断累积而增加。

每经过一个热循环，定量PCR仪通过荧光检测系统接收荧光信号强度，检测PCR扩增后所得产物量通过连续检测得到的反应动力学曲线，可计算出样品中模板DNA的初始含量该技术在科研工作中应用广泛，可用于疾病和食品安全的检测、对比相同基因在不同组织中相对表达量等例8】将新冠病毒不稳定的RNA转换成DNA后，技术人员常采用荧光定量PCR技術定量检测样本中病毒的核酸含量其原理如图9所示，在PCR反应体系中每加入一对引物的同时，加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接受到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成反应最终的荧光强度与PCR起始状态的含量呈正相关解析：在PCR扩增过程中，Taq酶遇到探针时会使荧光探针水解，因此，扩增次数越多，样品中病毒初始数量（病毒样品模板RNA含量）越多，反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关参考答案：模板DNAPCR方法自建立至今，极大地推进了生命科学研究的发展，也定会随着科学技术的发展继续被优化笔者仅仅是对考试题目中常见的PCR应用类型进行总结，无法完整囊括所有类型的应用，如将PCR用于性别鉴定、动植物DNA分型研究和基因进化研究等。

希望通过以上的总结能够帮助学生加深对PCR的理解，对PCR相关题目的解答起到触类旁通的作用Reference：[1]张礼堃，邹秉杰，宋沁馨，周国华.PCR技术在新冠病毒核酸检测中的应用[J].医学研究生学报，2021，34（5）：539-544.[2]孙娟.明悉引物设计参透PCR技术[J].生物学教学，2019，44（3）：37-40.[3]祁洋，李燕，王永智，尉亚辉.扩增T-DNA插入位点侧翼序列的方法及其应用进展[J].安徽农业科学，2009，37（17）：7907-7908，7927.[4]徐芳，姚泉洪，熊爱生，彭日荷，侯喜林，曹兵.重叠延伸PCR技术及其在基因工程上的应用[J].分子植物育种，2006，（5）：747-750.  -全文完-。