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引物合成介绍1. 引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法DNA合成仪有很多种，主要都是由 ABI/PE公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于 合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少申能博彩公司采用 的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman 1000M 和PE8909 DNA合成仪，引物修饰和高OD数合成采用ABI394等亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定 的特点亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成 的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'—5'磷酸二 酯键连接第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙 酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合， 得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶 液中游离的5'-羟基发生缩合反应第三步，带帽（capping）反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反 应（少于2%），用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以 在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上再以三氯乙 酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱 基被接上去合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化 引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260 定量，根据定单要求分装2. 引物纯化方式有哪些，如何选择？.C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机 溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分它不能有效去除比目的片 段短的小片段实际上，它是一种脱盐的作用这种方法一般不会对普通PCR 反应产生影响对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别OPC纯化：OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间 的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段OPC法纯化的DNA纯度大于95% 适用于40mer以下引物的纯化PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离， 然后从凝胶中回收目的DNA的方法。

PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化 方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA大于50mer）的纯化特别 有效HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化纯 度可以大于99%主要用于短链和修饰引物的纯化该法的弱点是成本较高，批 量生产效率不高3. 引物的OD数如何定量？答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm,石英 比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度测定时溶液的光密度最好稀释到 0.2-1.0之间DNA十粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD 值需要根据稀释倍数换算出母液的OD值4. 投诉定量不准是怎么回事儿？答：我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有（1）生 产人员定量错误这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格 的培训，程序化规范操作和换算公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要 故意少给用户OD数，因为无论OD数是否达到定单要求，我们都统计为工作量， 没有达到OD数的，分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了 合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。

一般情况下，引物都有留 样接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题2）分 装没有问题，但引物抽十或收样过程中，引物干粉可能意外丢失这种情况很少 见3）系统误差，我们认为10%左右为允许误差使用过程中，引物工作浓 度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验4）用户没有能够正确理解引物 OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用户没有 将OD读数，正确地转换成母液中OD数这种情况比较常见5）用户收到引 物十粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失例如，验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是：加入1ml水，彻底溶解 混匀后，取100ul,加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm,此 时光吸收的读数为0.25.需要什么级别的引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化根据实 验需要，确定订购引物的纯度级别应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增< 45baseOPC>45 basePAGE诊断PCR扩增< 40baseOPC, PAGEDNA测序20base左右OPC亚克隆，点突变等根据实验要求定OPC, PAGE， HPLC基因构建（全基因合成）根据实验要求定PAGE反义核酸根据实验要求定PAGE修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLC6. 最长可以合成多长的引物？答：引物越长，出现问题的概率就越大。

我们合成过120base的引物，但是产率 很低除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理 还有丢失很多，最后的产量是很低7. 需要合成多少OD数？答：根据实验目的确定一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标 准PCR反应如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了但是有些研 究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD做全基因构建的引物都比较长，但 是我们有些研究人员也要求高OD数片段越长，最后全长得率就越低，出错的 几率就越大超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同 时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重 复多次才能成功8. 如何检测引物的纯度？答：实验室方便的作法是用PAGE方法使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝 胶进行电泳取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素十 粉直到饱和，上样前加热变性（95°C,2mins）加入尿素的目的一是变性，二是增 加样品比重，容易加样600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶， 用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。

如 果条件许可，也可以用EB染色或银染方式染色9. 如何计算引物的浓度？答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定引物一般配制成10-50pmol/ul溶 解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致如果不一致， 请和我们联系我们可以根据生产记录查到实际产量是多少一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按 下列方式计算：V （微升）=OD数* （乘）33 * （乘）* （乘）20000 / （除）引物 的分子量引物的分子量可以从合成报告单上获得如果需要配制成其他浓度， 按上述公式换算注意：1 OD260= 33 ug/ml.10. 如何计算引物的Tm值？答：引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子 强度有关长度为25mer以下的引物，T”计算公式为：T” = 4C（G + C）+ 2C（A + T） 对于更长的寡聚核苷酸，t计算公式为：mTm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 （%GC） - 600/size 公式中，Size =引物长度Tm 的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cationsstabilize the DNA duplexes.11. 引物(含修饰)的分子量是如何确定的？答：非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标 示。

如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的 分子量二碱基数x碱基的平均分子量或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod> (Nx * Wx) +( Ni* Wi) +16* Ns - 62.NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod, Wmod分别为修 饰基团的数目和分子量对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分 子量为(313.21+329.21) /2 = 321.21Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分 子量16常规碱基分子量BaseMolecular WeightA313.21C289.18G329.21T304.19I314.2U290.17常规修饰基团分子量5’ -Biotin405.453’ -TAMARA623.605’ -(6 FAM)537.463’ -Dabsyl498.495’ -HEX744.133’ -(6 FAM)569.465’ -TET675.243’ -Amino ModifierC3153.075’ -Cy5533.633’ -Amino ModifierC7209.185’ -Cy3507.593’ -Thiol ModifierC3154.1212. 如何溶解引物？答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上 敲敲，将引物粉末收集到管底。

根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mMTris PH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底溶解引物 用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5)，引物在这 种条件下不稳定13. 如何保存引物？答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转。