FK506治疗大鼠早期膜性肾病的实验研究.doc

1FK506 治疗大鼠早期膜性肾病的实验研 究作者：贾冶 王晶 顾华 吴曼郭桥艳 徐锋 刘庆鑫 许钟镐 苗里宁【摘要】 目的 观察 FK506 治疗大鼠膜性肾病的疗效方法 复制 Wistar 大鼠膜性肾病模型实验分为 3 组：正常组(N 组)，模型组(M 组)，FK506 治疗组(FK506 组)，每组 12 只用阳离子化牛血清白蛋白制作大鼠膜性肾病模型,于正式免疫开始后2、4、6、8 w 检测大鼠 24 h 尿蛋白定量;最后心脏取血，测定血清肌酐、尿素氮、白蛋白水平处死大鼠后取肾观察肾组织病理改变;应用免疫组织化学方法检测肾组织中 TGF β1 与 NF κB 的表达，应用 Western 印迹法测定大鼠肾组织中TGF β1 蛋白表达的变化结果 M 组与 N 组相比出现大量蛋白尿，血清白蛋白水平降低免疫组化检测结果示 M 组 TGF β1 和 NF κB 的表达均高于 N 组，而 FK506 组的水平低于 M 组Western 印迹法显示 M 组及 FK506 组 TGF β1 高于 N 组，FK506 组的水平低于 M 组 结论 FK506 能降低膜性肾病大鼠尿蛋白，提高血清白蛋白，可抑制肾组织 TGF β1 与 NF κB 的表达，用其防治大鼠早期膜性肾病有较好的疗效。

【关键词】 FK506;TGF β1;膜性肾病【Abstract】 Objective To investigate the effect of FK506 on the membranous nephropathy in rat. Methods Membranous nephropathy rats were induced by C BSA. Wistar rats were divided into normal control (N),membranous nephropathy (M),and FK506 treatment (FK506) groups. Urinary protein excretion was measured at 2, 4, 6, 8 2w from the beginning of immunization. The rat blood was obtained via cardiac puncture, and the kidneys were removed. The blood samples were saved for measuring the levels of serum BUN, Scr and ALB. Kidney specimens were routinely processed for light microscopy. Immunohistochemistry method was performed to observe the expressions of TGF β1 and NF κB. TGF β protein expression was measured by Western blot. Results Urinary protein excretion in group M was significantly higher than that in group N. The level of serum ALB in group M was lower than that in group N. Up regulation of TGF β1 and NF κB expression were observed in immunohistochemical findings. Conclusions with that in M group, urinary protein excretion was significantly decreased and the level of serum ALB was significantly increased in FK506 group. Immunohistochemistry showed that the expressions of TGF β1 and NF κB were significantly lower in FK506 group than those in group M. The TGF β1 protein expression was significantly lower in FK506 group than that in M group by Western blot. Conclusions FK506 can reduce urinary protein excretion, increase the level of ALB, improve kidney pathological changes, inhibit TGF β1 overexpression and NF κB activation in renal tissue of membranous nephropathy rats, and can be used for treatment of early membranous nephropathy.【Key words】 FK506; TGF β1; Membranous nephropathy膜性肾病(membranous nephropathy，MN)是中老年人常见的肾脏疾病，临床以无症状蛋白尿或肾病综合征为主要表现，病理以肾小球基底膜(GBM)上皮细胞下弥漫的免疫复合物沉着伴基底膜增厚为特点。

MN 的病因及机制尚不清楚，目前治疗主要应用激素加免疫抑制剂FK506 做为一种新型的免疫抑制剂，目前主要用于器官移植，并且在治疗特异性皮炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性眼病等疾病中发挥作用，而在治疗肾小球肾炎，尤其是 MN 方面的研究尚少本实验观察FK506 对 MN 模型大鼠 24 h 尿蛋白定量、肾功能、肾组织 TGF β1、NF κB 的影响，旨在探讨 FK506 对 MN 的治疗作用及其机制1 材料与方法1.1 主要试剂和材料 FK506(爱尔兰藤泽药品有限公司)，牛血清白蛋白(上海缘聚生物科技有限公司)，碳化二亚胺(沈阳国药集团)，兔抗大鼠 TGF β1 多克隆3抗体(北京莱博生物实验材料研究所)，兔抗大鼠 NF κB p65 多克隆抗体(NF κB)(武汉博士德生物工程有限公司)，考马斯亮蓝法测尿蛋白试剂盒(南京建成生物工程有限公司)，免疫组织化学试剂盒(美国 Dako Corporation)1.2 方法 健康 Wistar 大鼠，雄性，重 200～230 g(吉林大学基础医学院动物实验中心)，参照 Border 法〔1〕建立大鼠 MN 模型，根据实验用药，将动物随机分为 3组，每组 12 只。

正常对照组(N 组);模型组(M 组)，不予任何药物治疗;FK506 治疗组(FK506 组)，由开始正式免疫第 3 周起每天给予 FK506(2 mg/kg)灌胃，共 4 wM 组和 N 组每日同等剂量溶媒灌胃实验中于模型大鼠正式免疫开始后2、4、6、8 w 将大鼠放入金属代谢笼中，准确收集 24 h 尿液留取最后一次 24 h尿液各组大鼠经乙醚麻醉，先行心脏取血，收集血样本，静置后 4℃离心 15 min，3 000 r/min，取血清保存在-70℃冰箱待测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)水平最后剖开腹腔，游离肾脏，取多块肾组织，一部分在-70℃冰箱保存，一部分置于 10%中性甲醛溶液中固定1.3 免疫组织化学法 采用免疫组化染色法，检测肾组织中 TGF β1 和NF κB 的表达情况石蜡切片常规脱蜡水化;1% H2O2 作用 15 min，PBS 洗;0.05%胰蛋白酶液 37℃作用 30 min，PBS 洗;10%正常山羊血清孵育 15 min 抑制非特异性结合;滴加 TGF β1 和 NF κB 一抗，4℃过夜，PBS 洗;滴加二抗(生物素化兔抗鼠IgG)，37℃孵育 30 min，PBS 洗;滴加复合物(链霉素抗生物素蛋白 过氧化物酶溶液)，37℃孵育 30 min;DAB 显色，水洗后用苏木素复染，透明封片。

1.4 Western 印迹法 用超声碎裂法提取蛋白后，根据蛋白浓度取等量蛋白，在12%十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳后转移至尼龙膜上在丽春红4染液中染色观察蛋白转移情况并标出蛋白质相对质量分子质量标准然后用 5%脱脂牛奶进行封闭，之后加入抗 TGF β1 进行杂交，4℃过夜洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体进行杂交，室温孵育 1 h再次洗膜后用 ECL 试剂显像并曝光成像利用图像分析系统扫描确定 X 片上杂交条带的相对吸光度值1.5 统计学处理 数据以 x±s 表示，应用 SPSS11.5 软件包进行统计分析，两组以上比较采用 ANOVA 检验2 结 果2.1 大鼠 MN 模型的建立 实验中发现大鼠自正式免疫后 2 w 出现蛋白尿,尿蛋白试纸测定结果为( ～ ),24 h 蛋白定量明显高于 N 组(P0.05)继续给予C BAS 后，第 4 周末时定性检查为( ～ )，24 h 尿蛋白定量明显增加，与 N 组比较提示为大量蛋白尿(P0.05)处死大鼠后留取血清测定ALB，与 N 组比较提示 ALB 水平降低(P0.05)，Scr、BUN 水平较正常无明显差异肾组织病理检查示肾小球毛细血管壁明显增厚、僵硬，偶可见钉突形成，肾小管上皮细胞弥漫性颗粒样及局灶空泡变性，小管内可见蛋白管型，PAM+MASSON 染色可见肾小球基底膜增厚、僵硬，偶可见钉突形成，上皮下疑似嗜复红物存在。

电镜观察示肾小球基底膜增厚，足突融合变平或消失，上皮下可见团块状电子致密物沉积，足细胞肿胀、形状不规则，胞质空化、轻度绒毛化，内质网扩张，溶酶体明显增多2.2 大鼠 24 h 尿蛋白、Scr、BUN、ALB 变化 与 N 组相比，M 组自正式免疫后 2、4、6、8 w 的尿蛋白定量均明显升高(P0.01)FK506 组于给药后 2、4 w5的 24 h 尿蛋白量均明显高于 N 组，但明显低于 M 组(2 w 时 P0.05，4、6、8 w时 P0.01)(见表 1)与 N 组比较，M 组的血清 ALB 水平降低(P0.01);FK506组 ALB 水平较 M 组明显升高(P0.01)(见表 1)各组间血清肌酐、尿素氮差异均无显著意义(见表 1) 2.3 免疫组化染色结果2.3.1 TGF β1 免疫组化染色结果 N 组大鼠肾脏中 TGF β1 阳性染色主要出现于皮髓交界的肾小管上皮细胞胞浆内，肾小球内几乎无表达;而 M 组大鼠肾小球系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞及周围肾小管上皮细胞内均有表达;FK506 组肾脏中 TGF β1 阳性染色强度和范围均较 M 组明显减轻(见图 1A)2.3.2 NF κB 免疫组化染色结果 N 组大鼠肾组织的肾小球囊侧壁上皮细胞、系膜细胞和肾小管上皮细胞内可见少量阳性染色，且以胞质内表达为主，表明NF κB 表达及活化较弱。

M 组及 FK506 组大鼠肾组织中肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞 NF κB 的表达较 N 组增强，且细胞核内表达较强而 FK506 组的阳性染色强度及范围较 M 组明显减轻，细胞核内表达较模型组明显减少(见图 1B)2.4 Western 印迹法结果 M 组及 FK506 组肾组织 TGF β1 表达高于 N 组，但FK506 组低于 M 组(见图 2)图 1 各组间 TGF β1(A)、NF κB(B)免疫组化染色表达的比较表 1 各组大鼠 24 h 尿蛋白定量及生化指标的变化3 讨 论MN 是一种以电子致密物在肾小球毛细血管壁上皮下沉积为特征的原位免疫。