重组DNA技术与基因工程4.ppt

重组DNA技术与基因工程5 2 3 4 1 6 重组DNA技术与基因工程的基本概念重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母中的表达4 目的基因的克隆与基因文库的构建基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中克隆目的基因目的基因获得之后，或确定其表达调控机制及生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达A 鸟枪法4 目的基因的克隆与基因文库的构建鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基本战略随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。

鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离 鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体鸟枪法克隆目的基因的基本战略如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；转化受体细胞 如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立） 鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 而提高重组子中目的重组子的出现频率 鸟枪法操作的改进例如：已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进在连接前将DNA片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb行拼接。

鸟枪法操作的改进冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法凝胶DNA片段回收技术 鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构B cDNA法4 目的基因的克隆与基因文库的构建cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA法分离目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性cDNA法克隆目的基因的基本战略mRNAcDNA第一链的合成 5’ppp’5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’5’ppp’5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTp 5’5’ppp’5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTp 5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPscDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA第二链的合成 煮沸NaOH自身引导法：获得的双链cDNA 5’ 端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAA5’ppp’5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTp 5’TTTTTTTTTTTTTTp 5’TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTOH 3’KlenowdNTPsS1DNApol dNTPsRNaesH置换合成法：获得的双链cDNA 5’ 端也会有几对碱基缺失。

5’ppp’5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTp 5’TTTTTTTTTTTTTTp 5’5’S1AAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTp 5’5’AAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTT 5’5’AAAAAAAAAAAAAA 3’3’T4-DNA ligasecDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA第二链的合成 dCTPTdT引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’ 端序列5’ppp’5G G AAAAAOH 3’TTTTTp 5’3‘ HO5’ppp’5G G AAAAAOH 3’3‘ HOCCCCCCCTTTTTp 5’3‘ HOCCCCCCCTTTTTp 5’3‘ HOCCCCCCCTTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG3‘ HOCCCCCCCTTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGGAAAAAOH 3’NaOH退火KlenowdNTPscDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA第二链的合成 cDNA法克隆目的基因的基本战略双链cDNA的克隆 双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收。

平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收，如RT-PCR cDNA法分离目的基因的基本程序完备分离程序 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等 cDNA法分离目的基因的基本程序特异分离程序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等 cDNA法分离目的基因的基本程序差异分离程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。

差异分离程序 多瘤病毒感染的FR3T3细胞正常的FR3T3细胞总mRNA总mRNAcDNA双链cDNA单链cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二链克隆提取mRNA共价交联上柱原位杂交病毒诱导表达的基因cDNA克隆cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因 C PCR法4 目的基因的克隆与基因文库的构建PCR法定向扩增目的基因的基本原理PCR克隆目的基因的基本程序盒式PCR扩增法PCR技术的诞生与发展反向PCR扩增法PCR技术的诞生与发展聚合酶链反应（ Polymerase Chain Reaction，PCR ）又称为PCR扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的Kary mullis发明了具有划时代意义的PCR技术；1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化；1993年，Kary mullis因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖；1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。

使用PCR技术克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应所需的双引物 PCR法定向扩增目的基因的基本原理5’5’目的基因5’变性加热5’ 5’引物退火5’ 5’底物聚合5’5’ 5’ 5’加热变性5’5’ 5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5‘ 5’5’5’5’5’5’5’5’5’退火 引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合123由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的PCR克隆目的基因的基本程序 基于T载体的切接克隆法：5’5’A ATT5’ 5’PCR扩增产物T 载体T7lacZ MCSoriAprT载体克隆 PCR克隆目的基因的基本程序基于同源重组的In-Fusion克隆法：5’ 5’5’ 5’5’ 5’与载体5’端15个碱基相同的序列目的基因序列PCR扩增In-Fusion酶介导同源重组盒式PCR扩增法染色体DNASau3A部分酶切加装盒式接头片段5’ 端不含磷酸基团变性 引物退火扩增P1P2P1P2退火延伸测序设计保守引物基因组DNA切割并自连成环反向PCR扩增法TAGTSLVVRKNYWSSAEPHC蛋白质5’5’5’ 5’5’5’5’5’根据已知的氨基酸序列设计简并引物简并引物介导RT-PCR保守引物介导PCR测序确定目标基因的两端序列D 化学合成法4 目的基因的克隆与基因文库的构建化学合成法的基本战略化学合成的单元操作DNA化学合成的用途化学合成法的基本战略 全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：小片段粘接法： 混合退火根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段。

T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 补钉延长法： 混合退火根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合化学合成法的基本战略 全基因合成大片段酶促法： 混合退火根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合化学合成法的基本战略 全基因合成或RCR扩增上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%化学合成法的基本战略 全基因合成化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子。

由于大多数氨基酸拥有简并密码子故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成某段连续的氨基酸序列：Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile所有可能的DNA序列：TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATAC T GATG G G T TCCGACGGCGTCGC设计的简并探针序列：TGTATGGACGAIAT。