分子生物学导论分子生物学研究方法课件.ppt

第九章第九章分子生物学研究方法分子生物学研究方法(2)1第四节第四节 DNA重组技术重组技术一、目的DNA片段的获得二、载体 （质粒、噬菌体、cos质粒、病毒）三、DNA酶切四、DNA的连接和转化五、重组质粒的筛选和鉴定 1. 质粒DNA的提取 2. 质粒DNA的纯化 3. 重组质粒的筛选和鉴定2DNA重组 DNA重组是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程又称DNA克隆、分子克隆、基因操作3重组DNA技术史上的主要事件1967年　第一次发现DNA连接酶1970年　分离了第一种限制性内切核酸酶，发现了反转录酶1972年　获得第一个重组DNA分子1973年　完成第一例细菌克隆1975-1977年　发明了DNA序列测定技术，1977年完成了全长5387bp噬菌体f174基因组测定1978年　首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素1981年　获得转基因小鼠和转基因果蝇1983年　获得第一例转基因植物1986年　GMO首次在环境中释放1994年　第一批基因工程西红柿在美国上市2000年　完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定(1.2X108bp)2001年　完成第一个人类基因组全序列测定(2.7X109bp)2005年　中、美、日科学家联合完成水稻基因组全序列测定4第一个第一个 DNA 重组子重组子 （（Paul Berg, 1972））EcoRI recognition sitesλ phage DNAEcoRI cuts DNA into fragmentsSticky endSV40 DNAThe two fragments stick together by base pairingDNA ligaseRecombinant DNA5DNA重组的一般步骤重组的一般步骤1. 从生物有机体基因组从生物有机体基因组中，分离出带有目的基中，分离出带有目的基因的因的DNA片段。

片段2. 将带有目的基因的外源将带有目的基因的外源DNA片段连片段连接到能够自我复制的并具有选择记号接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组的载体分子上，形成重组DNA分子63. 将重组将重组DNA分子转移分子转移到适当的受体细胞（亦到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一称寄主细胞）并与之一起增殖4. 从大量的细胞繁殖群从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重体中，筛选出获得了重组组DNA分子的受体细胞，分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增并筛选出已经得到扩增的目的基因的目的基因78酶酶       类类功功      能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNA连接酶连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段片段连接成一个连接成一个DNA分子分子DNA聚合酶聚合酶I（大肠杆菌）（大肠杆菌） 按按5'到到3'方向加入新的核苷酸，补平方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口双链中的缺口反转录酶反转录酶按照按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成互补原则合成DNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末末端（进行末端标记实验或用来进行端（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接的连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶外切酶III从从DNA链的链的3'末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体噬菌体DNA外切酶外切酶从从DNA链的链的5'末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNA链链5'或或3'末端的磷酸基团末端的磷酸基团重组重组DNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶9Ø 生物基因组DNAØ 细胞mRNA反转录合成的单链cDNA 通过机械切割、核酸限制性内切酶消化等处理成适合克隆的DNA小片段Ø 通过PCR技术可以获得目的基因Ø 人工化学直接合成一、目的DNA片段的获得10（一）特点 基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞自主复制的DNA分子。

二、载体1.在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的DNA 片段得以扩增2.分子量尽可能小，多拷贝、松驰控制型3.能插入较大的外源DNA 片段4.载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）5.载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选11多克隆位点lacZ’载体名称载体大小选择性标记基因多克隆位点多克隆位点(multiple cloning sites，，MCS) 指多个限制性内指多个限制性内切酶的单一切点切酶的单一切点 由许多限制酶切位点组成，往往是人工由许多限制酶切位点组成，往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列 12（二）类型从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为： 克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等DNA 克隆常用的载体有： 质粒载体（plasmid），如PBR322、PUC系列、PGEM 系列和pBluescript（简称pBS）等； 噬菌体载体（phage）； 柯斯质粒载体（cosmid）； 单链DNA 噬菌体载体（ssDNA phage ）； 噬粒载体（phagemid）； 酵母人工染色体（YAC）； 细菌染色体克隆载体（BAC）等。

131. 质粒载体质粒载体        是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb 不不等，为等，为双链、闭环双链、闭环的的DNA 分子，并以分子，并以超螺旋超螺旋状态存在于状态存在于宿主细胞中质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，宿主细胞中质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有它具有自主复制和转录能力自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息拷贝数，并表达所携带的遗传信息作为克隆载体的质粒应具备以下特点作为克隆载体的质粒应具备以下特点:        ①① 分子量小，稳定存在，较高拷贝数；分子量小，稳定存在，较高拷贝数；        ②② 遗传标志；遗传标志；        ③③ 内切酶点内切酶点14（（1））pBR322质粒载体质粒载体123来源于来源于pSF2124质质粒转座子粒转座子Tn3的氨的氨苄青霉素抗性基苄青霉素抗性基因（因（ampr））来源于来源于pSC101质粒的四环素质粒的四环素抗性基因抗性基因（（tertr））来源于来源于ColE1的派生质粒的派生质粒pMB1的的DNA复制起点复制起点（（ori））15（（2））pUC质粒载体质粒载体氨苄青霉素氨苄青霉素抗性基因抗性基因(ampr)大肠杆菌大肠杆菌β-半半乳糖酶基因乳糖酶基因(lacZ)的启动的启动子及其编码子及其编码α-肽链的肽链的DNA序序列列位于位于lacZ基基因中的靠近因中的靠近5’-端的一段端的一段多克隆位点多克隆位点(MCS)区段，区段，它并不破坏它并不破坏该基因的功该基因的功能。

能来自来自pBR322质粒的复制起质粒的复制起点（点（ori））16（（3））pMD19-T质粒质粒172. 噬菌体载体噬菌体载体 （（1）噬菌体的生物学特性）噬菌体的生物学特性     溶菌周期溶菌周期指噬菌体将指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体烈性噬菌体只具有烈性噬菌体只具有溶菌生长周期溶菌生长周期)        溶源周期溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制主细胞的分裂而进行复制温和噬菌体具有溶源生长温和噬菌体具有溶源生长周期和溶菌生长周期周期和溶菌生长周期)18（（2））λ噬菌体噬菌体A. 生物学特性生物学特性     组成组成：：蛋白质外壳蛋白质外壳和和线状线状双链双链DNA分子组成分子组成        DNA长度为长度为48502bp，在，在分子两端各有分子两端各有12个碱基的单链个碱基的单链互补粘性末端。

当其注入到寄互补粘性末端当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成两个粘性末端的互补作用形成双链的环形双链的环形DNA分子上述通分子上述通过粘性末端互补形成的双链区过粘性末端互补形成的双链区被称为被称为cos位点位点（（cohesive end site）19•  温和噬菌体温和噬菌体    一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期•  复制复制    溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制;    溶菌周期的早期是溶菌周期的早期是“θ”复制，晚期进行滚环复制复制，晚期进行滚环复制•  基因组成基因组成      DNA至少包括至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／／3为非必须区段为非必须区段 20B. 类型类型•插入型插入型 （（Insertion vectors））      这种载体仅仅有一个可供外源这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。

插入的克隆位点      如：如：λgt10 、、 λgt11               克隆能力小，不到克隆能力小，不到10kb•置换型置换型 （（Replacement vectors））      这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的的λDNA区段是区段是λ噬菌体的非必需序列，可以被外源插入噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的的DNA取代      如：如：Charon 4 载体载体             克隆能力大，克隆能力大，20～～25kb21（（3））M13噬茵体噬茵体单链闭合环状噬菌体单链闭合环状噬菌体         只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约长约6.4kb，可分为，可分为10个区和个区和507 bp基因间隔区（基因间隔区（IS区），该区），该区可以接受外源区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力的插入而不会影响到噬菌体的活力这是该噬菌体能这是该噬菌体能用作单链用作单链DNA载体载体的重要前提的重要前提22复制与增殖复制与增殖(1)M13(+)链链DNA进入细胞内部进入细胞内部(2)合成出互补的合成出互补的(-)链链 DNA, 此双链形式此双链形式的的M13 DNA，称为复制型，称为复制型 DNA。

3)按按θ形式进行几轮复制之后，基因形式进行几轮复制之后，基因 Ⅱ的的产物便在产物便在RF DNA的正链特定位点上的正链特定位点上作切割反应，形成一个缺口作切割反应，形成一个缺口4)M13基因组利用大肠杆菌的基因组利用大肠杆菌的DNA聚合聚合酶酶I，以环形的，以环形的MI3(-)DNA为模板合成为模板合成 M13(+)DNA当DNA复制叉沿着模板复制叉沿着模板DNA分子转移到复制终点时，在基因分子转移到复制终点时，在基因Ⅱ编码产物的作用下，新合成的编码产物的作用下，新合成的(+)DNA便会被切除下去，并进一步环便会被切除下去，并进一步环化形成单位长度的化形成单位长度的 M13基因组基因组DNA 233、、柯斯质粒载体柯斯质粒载体柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)又称又称粘粒粘粒，， “cosmid”一词一词是由英文是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而缩写而成的，其原意是指带有成的，其原意是指带有粘性末端位点的质粒粘性末端位点的质粒所谓柯斯质粒其实是一所谓柯斯质粒其实是一类由人工构建的含有类由人工构建的含有λDNA的的cos序列和质粒序列和质粒复制子的特殊类型的质复制子的特殊类型的质粒载体，具有与质粒相粒载体，具有与质粒相同的结构特点，为同的结构特点，为双链、双链、环状环状DNA。

24柯斯质粒具有下列柯斯质粒具有下列特点特点：：①① 具有质粒载体的特性具有质粒载体的特性②② 带有带有λ噬菌体的粘性末端噬菌体的粘性末端(cos区区)③③ 一个或多个酶切位点一个或多个酶切位点④④ 具有高容量的克隆能力具有高容量的克隆能力⑤⑤ 非重组体粘性质粒很小，不能在非重组体粘性质粒很小，不能在体外包装，因而有利于重组体的筛体外包装，因而有利于重组体的筛选 25类型类型：：（（1））重组型病毒载体重组型病毒载体                （（2）无病毒基因的病毒载体）无病毒基因的病毒载体——复制缺陷型复制缺陷型                                                      可复制型可复制型  复制缺陷型复制缺陷型4. 病毒载体病毒载体组成组成：：（（1））病毒复制和包装元件病毒复制和包装元件（（2）病毒基因）病毒基因（（3）插入的外源基因或元件）插入的外源基因或元件（（4）病毒外壳）病毒外壳/外膜外膜                             26优点优点：：（（1））利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；（（2）复杂的装配过程由细胞完成；）复杂的装配过程由细胞完成；（（3）不同的病毒载体具有不同的表达特点。

不同的病毒载体具有不同的表达特点27常用的病毒载体的特点：常用的病毒载体的特点：病毒载体病毒载体生物学特性生物学特性适用范围适用范围反转录病毒载体反转录病毒载体      单链单链RNA病毒病毒      8~10kb可感染分裂细胞；可感染分裂细胞；整合到染色体中；整合到染色体中；表达时间较长；表达时间较长；有致癌的危险；有致癌的危险；Ex vivo基因治疗；基因治疗；肿瘤基因治疗肿瘤基因治疗腺病毒载体腺病毒载体      双链双链DNA病毒病毒      36kb可感染分裂和非分裂细胞；可感染分裂和非分裂细胞；不整合到染色体中；不整合到染色体中；外源基因表达水平高；外源基因表达水平高；表达时间较短；表达时间较短；免疫原性强；免疫原性强；In vivo基因治疗；基因治疗；肿瘤基因治疗；肿瘤基因治疗；疫苗AAV病毒载体病毒载体      单链单链DNA病毒病毒      ~5kb可感染分裂和非分裂细胞；可感染分裂和非分裂细胞；整合到染色体中；整合到染色体中；无致病性；免疫原性弱；无致病性；免疫原性弱；可长期表达外源基因；可长期表达外源基因；在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达较高；织中表达较高；In vivo 基因治疗；基因治疗；Ex vivo基因治疗；基因治疗；遗传病基因治疗；遗传病基因治疗；获得性慢性疾病的获得性慢性疾病的基因治疗。

基因治疗HSV病毒载体病毒载体      双链双链DNA病毒病毒      152kb具有嗜神经性；可逆轴突传递；具有嗜神经性；可逆轴突传递；可潜伏感染；可潜伏感染；容量大；容量大；可感染分裂和非分裂细胞；可感染分裂和非分裂细胞；神经系统疾病的基神经系统疾病的基因治疗；因治疗；肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗28•  根据限制酶的识别切割特性，根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰催化条件及是否具有修饰酶活性可分为酶活性可分为Ⅰ、、Ⅱ、、Ⅲ型三大类型三大类•  Ⅰ类和类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖作用及依赖ATP的限制性内切酶活性的限制性内切酶活性 •  Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端特异性切割末端•  Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来•  故故Ⅰ类和类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用类酶在基因工程中基本不用。

   1. 限制酶的类型限制酶的类型 三、三、DNA酶切酶切29Ⅱ型酶型酶• Ⅱ型酶就是通常指的型酶就是通常指的DNA限制性内切酶限制性内切酶.• 它们能识别双链它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的产生特异的DNA片段；片段； • Ⅱ型酶分子量较小，仅需型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； • Ⅱ型内切酶切割双链型内切酶切割双链DNA产生３种不同的切口－－产生３种不同的切口－－５５’端突端突出；３出；３’端突出和平末端端突出和平末端• 正是得益于限制性内切酶的发现和应用，正是得益于限制性内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体才使得人们能在体外有目的地对遗传物质外有目的地对遗传物质DNA进行改造，从而极大地推动了分子进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展生物学的兴旺和发展3031同尾酶同尾酶(Isocaudamer)        能切割产生相同末端的限制性内切酶，一般是指能产生相能切割产生相同末端的限制性内切酶，一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。

具有不同识别序列的限制性内切酶同粘性末端的限制酶具有不同识别序列的限制性内切酶,切切割割DNA分子后产生相同的粘性末端例如：分子后产生相同的粘性末端例如：SalI与与XhoI, BamHI与与BglⅡ         所有平末端酶产生的末端均是相同的，但一般不把它作为所有平末端酶产生的末端均是相同的，但一般不把它作为同尾酶来研究同尾酶来研究同裂酶同裂酶(Isoschizomers )        来源于不同物种但能识别相同来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同比如切割位点可以相同也可以不同比如Sma1和和Xma1，它们均识，它们均识别别CCCGGG，但前者切后产生平末端，后者切后产生粘性末，但前者切后产生平末端，后者切后产生粘性末端 32（一）（一） DNA的连接的连接        1.  DNA连接酶连接酶            通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，从而修复缺口通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，从而修复缺口或催化粘合完全分离的两个或催化粘合完全分离的两个DNA片段eg: T4 DNA ligase                      T4 DNA连接酶连接酶（需要（需要ATP作为辅助因子）主要用于：作为辅助因子）主要用于：           （（1）连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；）连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；           （（2）双链）双链DNA分子间的平端；分子间的平端；           （（3）在双链平端的）在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或分子上添加合成的人工接头或                       适配子。

适配子四、四、DNA的连接和转化的连接和转化332. 粘性末端连接粘性末端连接连接后可能出现以下问题：连接后可能出现以下问题：      （（1）载体自身环化，造成假阳性背景克隆，为避免此）载体自身环化，造成假阳性背景克隆，为避免此问题，可在连接前，用问题，可在连接前，用碱性磷酸酶碱性磷酸酶将载体将载体DNA 5’- 端去磷端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接；酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接；     （（2）插入片段可双向插入；）插入片段可双向插入；     （（3）插入片段可多拷贝插入插入片段可多拷贝插入343. 平端连接平端连接        平端连接的优点是可用平端连接的优点是可用T4连接酶连接任何连接酶连接任何DNA平端，平端，这对不同这对不同DNA分子的连接十分有利分子的连接十分有利        平端连接的主要问题是，它的连接效率比粘性末端低，平端连接的主要问题是，它的连接效率比粘性末端低，因此需较多的因此需较多的T4 DNA连接酶和较高的底物浓度，聚乙二醇连接酶和较高的底物浓度，聚乙二醇（（PEG）可促进平端连接反应可促进平端连接反应4. 人工接头连接人工接头连接5. 利用适配子连接利用适配子连接35（二）重组（二）重组DNA的转化的转化        1. 转化（转化（transformation））            指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。

接受转化程接受转化DNA的菌株称为的菌株称为受体菌株受体菌株受体菌株受体菌株            转化时，细菌必须经过适当的处理（如电击法，转化时，细菌必须经过适当的处理（如电击法，CaCl2，，RbCl(KCl)等化学试剂），使之处于等化学试剂），使之处于感受态感受态 — 即容即容易接受外源易接受外源DNA的状态，然后利用短暂的状态，然后利用短暂热休克热休克使使DNA导入导入细菌宿主中细菌宿主中            转化过程所用的受体细胞一般是转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷限制修饰系统缺陷的的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-，，M-)，它可以容忍外源，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代分子进入体内并稳定地遗传给后代36常用的大肠杆菌菌株： DH5a JM109 TOP10常用的农杆菌菌株： EHA105 LAB440437（（1）将快速生长中的大肠杆菌置于经）将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（低温（0℃）预处理的低）预处理的低渗氯化钙渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。

溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）步骤：步骤：（（2）与转化混合物中的外源）与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物形成粘附在细胞表面的复合物3）立即将该体系转移到）立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收被细胞所吸收38（（5）涂布于选择性培养基中分离）涂布于选择性培养基中分离转化子4）在全培养基中生长一段时间）在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性使转化基因实现表达、细胞活性恢复恢复392. 转染和感染转染和感染感染感染：在体外将噬菌体：在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌其感染受体菌转染转染：在：在DNA连接酶作用下使噬菌体连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌但习惯上常把以噬菌重组质粒一样地转化进受体菌但习惯上常把以噬菌体体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染 40五、重组质粒的筛选和鉴定五、重组质粒的筛选和鉴定（一）质粒（一）质粒DNA的提取的提取1. 细菌的收获细菌的收获    含相应抗生素的液体培养基里培养含相应抗生素的液体培养基里培养 → 移至移至1.5ml离心管离心管 → 离心沉淀细胞离心沉淀细胞2. 细菌的裂解细菌的裂解   （（1）碱裂解法）碱裂解法   （（2）煮沸法）煮沸法 从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。

41                           碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNA        根据根据Birnboim和和Doly（（1979）以及）以及Ish-Horowicz和和Burke（（1981）的方法修订而成的应用最为广泛的制备质粒）的方法修订而成的应用最为广泛的制备质粒DNA的方法之一的方法之一        优点优点：收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可：收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的满足多数的DNA重组操作重组操作       基本原理基本原理：当菌体在：当菌体在NaOH和和SDS溶液中裂解时，蛋白质溶液中裂解时，蛋白质与与DNA发生变性，当加入中和液后，发生变性，当加入中和液后，质粒质粒DNA分子能够迅速分子能够迅速复性复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体蛋白质与染色体DNA不复性不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来用酒精沉淀法可以收集而呈絮状，离心时可沉淀下来用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒仍然滞留在上清液中的质粒DNA十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠（（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。

细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性42        纯化质粒纯化质粒DNA的方法通常是利用了的方法通常是利用了质粒质粒DNA相对较相对较小小及及共价闭环共价闭环两个性质例如，氯化铯两个性质例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时对于小量制沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时对于小量制备的质粒备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的，所得纯化的质粒质粒DNA已可满足细菌转化、已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用二）质粒（二）质粒DNA的纯化的纯化43上清液上清液       加入固体加入固体CsCl与与EtBr溶液溶液       室温室温下超速离心下超速离心(45,000rpm））16小时小时      穿孔取出穿孔取出DNA（（320nm））    异丙醇抽提溴乙锭异丙醇抽提溴乙锭       缓冲缓冲液透析除去残余液透析除去残余CsCl       两倍体积冷乙醇沉淀两倍体积冷乙醇沉淀DNA        离心、洗涤、干燥离心、洗涤、干燥氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法实验表明，在细胞裂解及实验表明，在细胞裂解及DNA分离的过程中，大分子量的分离的过程中，大分子量的细菌染色体细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。

这种差别对质粒整的状态这种差别对质粒DNA的纯化是十分有用的的纯化是十分有用的44缺点缺点         通过氯化铯通过氯化铯-EtBr密度梯度离心法虽然可密度梯度离心法虽然可以得到高纯度、高质量的质粒以得到高纯度、高质量的质粒DNA，，但它操但它操作复杂，需要价格昂贵的氯化铯和超速离心作复杂，需要价格昂贵的氯化铯和超速离心机设备，而且溴化乙锭又是一种致癌物质，机设备，而且溴化乙锭又是一种致癌物质，如果操作不慎，不仅会造成环境污染，还会如果操作不慎，不仅会造成环境污染，还会危及实验工作人员的身心健康危及实验工作人员的身心健康451. 抗药性标志的筛选抗药性标志的筛选2. β－半乳糖苷酶系统筛选－半乳糖苷酶系统筛选 – 蓝白斑筛选蓝白斑筛选（三）重组质粒的筛选和鉴定（三）重组质粒的筛选和鉴定 现在使用的许多质粒载体现在使用的许多质粒载体 (如如pUC系列、系列、pBluescript、、pGem和它们的衍生载体和它们的衍生载体)都带有一个大肠杆菌都带有一个大肠杆菌DNA的短片段，其中含的短片段，其中含有有β-半乳糖苷酶前半乳糖苷酶前146个氨基酸个氨基酸的编码信息及调控序列的编码信息及调控序列。

    在各自独立的情况下，在各自独立的情况下，pBS(pUC、、pGem等等)和和DH5 a编码的编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性但在半乳糖苷酶的片段都没有酶活性但在pBS 和和DH5 a融为一体融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质这种时可形成具有酶活性的蛋白质这种lacZ基因上缺失近操纵基基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象叫阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补互补46Lac+细菌，在生色底物X-gal的存在下被IPTG诱导形成蓝色菌落带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性，显白色菌落473. 菌落快速裂解鉴定法菌落快速裂解鉴定法菌落裂解后去除蛋白，直接凝胶电泳检测菌落裂解后去除蛋白，直接凝胶电泳检测4. 通过聚合酶链反应筛选重组子通过聚合酶链反应筛选重组子 1 2 3 4 5 6 空白空白 P Ds5′基因特异引物485. 内切酶图谱鉴定内切酶图谱鉴定6. 菌落或噬菌斑原位杂交菌落或噬菌斑原位杂交BamH Ⅰ/ Pst I1 2 3 4 制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。

众多的转化子中筛选目的克隆        目的基因特异的核酸探针目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因可以是已获得的部分目的基因片段，或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚片段，或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸核苷酸, 或其它物种的同源基因或其它物种的同源基因49第五节第五节 基因分离技术基因分离技术一、克隆的概念二、克隆基因的分离 1. 应用核酸探针 2. 应用mRNA差别显示 3. 应用cDNA差示分析 4. 应用酵母双杂交体系 5. 基因的图位克隆法 6. Microarray(教材教材p.182-187)50一、克隆的概念一、克隆的概念克隆克隆可以理解为复制、拷贝，就是从原型中产生出同可以理解为复制、拷贝，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同51分子水平：分子水平： DNA克隆，也叫分子克隆含义是将某一特克隆，也叫分子克隆含义是将某一特定定DNA片断通过重组片断通过重组DNA技术插入到一个载体技术插入到一个载体(如质粒和如质粒和病毒等病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该量完全相同的该DNA片断的片断的“群体群体”。

细胞水平细胞水平：指由同一个祖细胞（：指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体来的一群遗传上同一的子细胞群体个体水平：个体水平：指基因型完全相同的两个或更多的个体组成指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体的一个群体 如：从同一受精卵分裂而来的单卵双生子如：从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（（monozygotic twins）便是属于同一克隆便是属于同一克隆521. 应用核酸探针分离克隆目的基因应用核酸探针分离克隆目的基因二、克隆基因的分离二、克隆基因的分离        把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落或噬菌班杂交，就可以与特异性的核酸探针进行菌落或噬菌班杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆这个过程叫做以便筛选出具有目的基因的阳性克隆这个过程叫做克隆基因的分离或筛选克隆基因的分离或筛选　　应用核酸探针分离目的基因的方法叫做　　应用核酸探针分离目的基因的方法叫做核酸杂交核酸杂交筛选法筛选法此法应用广泛，相当有效，尤其适用于大规此法应用广泛，相当有效，尤其适用于大规模筛选。

模筛选 532. 应用应用mRNA差别显示技术差别显示技术(DDRT-PCR)分离克隆目的基因分离克隆目的基因        在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序的表达方细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序的表达方式，叫做式，叫做基因的差别表达基因的差别表达（（differential expression）54553、应用、应用cDNA差示分析法克隆基因差示分析法克隆基因         这种方法能够充分发挥这种方法能够充分发挥PCR技术以指数形式扩增双技术以指数形式扩增双链链DNA模板的性质，通过降低模板的性质，通过降低cDNA群体复杂性和更换群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法特异性扩增目的基因片段两端接头等方法特异性扩增目的基因片段        因为试验对象（因为试验对象（tester）和供试探针（）和供试探针（driver）在接）在接受差示分析前均经过一个受差示分析前均经过一个4碱基切割酶的处理，形成碱基切割酶的处理，形成平均平均长度长度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息被扩增。

每的代表群，保证绝大部分遗传信息被扩增每次次t减减d反应后仅设置反应后仅设置72℃复性与延伸，复性与延伸，94℃复性这两个复性这两个参数共参数共20个个PCR循环，循环，PCR产物的特异性和所得探针的产物的特异性和所得探针的纯度非常高纯度非常高56574、应用酵母双杂交体系克隆基因、应用酵母双杂交体系克隆基因 5、基因的图位克隆法、基因的图位克隆法 586、、DNA的的Microarray59Infected IBLUninfected IBL60第六节第六节 分子杂交技术分子杂交技术一、Southern印迹杂交(DNA) 二、Northern印迹杂交 （RNA）三、斑点杂交 （dot blotting）四、Western印迹杂交 （Protein）五、原位杂交六、基因芯片 七、酵母杂交技术61杂交杂交(hybridization) ：：两条两条来源不同来源不同的单链核酸（的单链核酸（DNA或或RNA），只要它们），只要它们有大致相同有大致相同的互补碱基顺序，经退火的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交。

的分子杂交注意与复性的区别）（注意与复性的区别）核酸杂交可以是核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是，也可以是DNA-RNA杂交62        在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到到滤膜滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为上去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交印迹杂交”        分子杂交是目前分子生物学最广泛应用的技术之一分子杂交是目前分子生物学最广泛应用的技术之一利用此技术，可以求出特定基因的频率、基因组织的特利用此技术，可以求出特定基因的频率、基因组织的特点、基因结构和定位、基因表达等点、基因结构和定位、基因表达等 电泳凝胶核酸印迹法电泳凝胶核酸印迹法斑点和狭线印迹法斑点和狭线印迹法菌落和噬菌斑印迹法菌落和噬菌斑印迹法63E.M. Southern于于1975年首先设计出来的年首先设计出来的材料：材料：尼龙滤膜尼龙滤膜硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜二乙氨基乙基纤维素滤膜（二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE））步骤：步骤：第一：将分离的核酸样品第一：将分离的核酸样品转移转移到固体支持物滤膜上到固体支持物滤膜上－－核酸印迹转移核酸印迹转移第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的它标记的DNA探针探针进行进行杂交杂交一、一、Southern印迹杂交印迹杂交(DNA) 64Southern Blotting的过程的过程1. 碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA2. 通过电泳液的移动转移胶中的通过电泳液的移动转移胶中的DNA3. 固定胶中的固定胶中的DNA到膜上到膜上4. 预杂交和杂交（放射性和荧光检测）预杂交和杂交（放射性和荧光检测）5. 结果检测结果检测65M1 210×SSC转移转移缓冲液缓冲液Whatman滤纸滤纸凝胶凝胶Whatman滤纸滤纸纸巾纸巾玻璃板玻璃板重物重物支持物支持物500g1 2与探针同源杂交的与探针同源杂交的基因基因DNA片段片段基因组基因组DNADNA酶切片段酶切片段内切酶内切酶NC或尼龙膜或尼龙膜NC膜或尼龙膜膜或尼龙膜66        将将RNA分子从电泳分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。

杂交的一种实验方法二、二、Northern印迹杂交印迹杂交 （（RNA））6768三、斑点杂交三、斑点杂交 （（dot blotting）） 69四、四、Western印迹杂交印迹杂交 （（Protein））70Step 2.  Secondary Antibodyrecognition of primary AbStep 3.  Color DevelopmentStep 1.  Antibody Recognitionof target protein/antigen7172        组织原位杂交简称原位杂交（组织原位杂交简称原位杂交（in situ hybridization），），是在是在细胞保持基本形态细胞保持基本形态的情况下将的情况下将探针注入细胞内与探针注入细胞内与RNA或或DNA杂交，杂交，杂交反应在载物杂交反应在载物片上的细胞内进行片上的细胞内进行        基本步骤是通过适当处基本步骤是通过适当处理使细胞渗透性增加，探针理使细胞渗透性增加，探针进入细胞内与进入细胞内与DNA或或RNA杂交、冲洗等用放射自显杂交、冲洗等用放射自显影或免疫酶法或荧光显示杂影或免疫酶法或荧光显示杂交结果。

交结果五、原位杂交（教材五、原位杂交（教材P175）） 73Localization of DNALocalization of RNA74荧光原位杂交(Florescence In-Situ Hybridization, FISH) 一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术FISH技术是将荧光基团标记特异性的DNA探针，再将标记了荧光信号的探针与待测样本进行原位杂交，最后在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数75研究DNA分子水平上的多态性RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制片段长度多态性)，是根据不同品种(个体)基因组的限制性内切酶的酶切碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺少，导致酶片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针进行检测六、RFLP和RAPD76RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, 限制片段长度多态性）限制片段长度多态性）77RAPD (randomly amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)建立于PCR技术基础上，利用一系列引物对所研究基因组DNA进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经放射自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区段的DNA多态性。

如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变78若位点2处碱基发生改变，则79        基因芯片（基因芯片（Gene Chip）通常指）通常指DNA芯片，其基本原理芯片，其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量子的数量 七、基因芯片（教材七、基因芯片（教材p.214-218）） 8081（一）基因芯片的种类（一）基因芯片的种类1、光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列、光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列2、微电子芯片、微电子芯片3、微量点样技术、微量点样技术4、其他技术、其他技术（二）应用领域（二）应用领域1、科研领域、科研领域2、生物制药领域、生物制药领域3、医学诊断、医学诊断82（一）酵母双杂交技术（一）酵母双杂交技术        运用基因重组技术将已知蛋白的运用基因重组技术将已知蛋白的DNA序列连接到带序列连接到带有酵母转录因子的有酵母转录因子的DNA结合结构域（结合结构域（BD））编码区的表达编码区的表达载体上，转化酵母后能够形成融合蛋白（载体上，转化酵母后能够形成融合蛋白（诱饵蛋白诱饵蛋白）。

将）将已知编码已知编码转录激活结构域（转录激活结构域（AD ））的的DNA分别与待筛选的分别与待筛选的cDNA文库中的不同插入片段相连接，在酵母中表达形成文库中的不同插入片段相连接，在酵母中表达形成融合蛋白（融合蛋白（猎物蛋白猎物蛋白）如果诱饵蛋白和猎物蛋白能够相）如果诱饵蛋白和猎物蛋白能够相互作用，互作用，AD和和BD结构域会被拉近，从而激活报告基因的结构域会被拉近，从而激活报告基因的表达这是一种研究蛋白质相互作用的方法这是一种研究蛋白质相互作用的方法八、酵母杂交技术（教材八、酵母杂交技术（教材p.206-208）） 83BD：：DNA结合结构域结合结构域AD：转录激活结构域：转录激活结构域848586（二）酵母单杂交技术（二）酵母单杂交技术顺式作用元件顺式作用元件基本启动子基本启动子报告基因报告基因转录因子转录因子AD        运用基因重组技术将特定顺式作用元件构建到基本启运用基因重组技术将特定顺式作用元件构建到基本启动子上游，把报告基因连接到基本启动子下游将动子上游，把报告基因连接到基本启动子下游将待测转待测转录因子录因子cDNA与已知酵母激活域（与已知酵母激活域（AD ））的融合表达载体的融合表达载体转入酵母，如果待测转录因子能和顺式作用元件结合，就转入酵母，如果待测转录因子能和顺式作用元件结合，就能激活基本启动子，从而激活报告基因的表达。

这是一种能激活基本启动子，从而激活报告基因的表达这是一种研究研究DNA和蛋白质互相作用和蛋白质互相作用的系统87酵母单杂与双杂的原理比较：酵母单杂与双杂的原理比较：8889。