骨髓细胞微核实验.ppt

骨髓细胞微核实验•微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法•微核(Micronucleus,MCN)是指细胞中主核之外的颗粒，染色与细胞核一致，相当于细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或杏仁状是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂时滞留在细胞核外的遗传物质实验原理实验原理机理：1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，从而遗留在细胞质中结论： 微核试验能检测化学或其他物质因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点实验原理实验原理无核细胞无核细胞红细胞红细胞有核细胞中有核细胞中微核难与正常核分叶微核难与正常核分叶及核突出物区别及核突出物区别微微核核实实验验红细胞的分化成熟过程小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成8环磷酰胺（CTX）v最常用的烷化剂类抗肿瘤药最常用的烷化剂类抗肿瘤药v在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。

v副作用明显，有恶心、食欲减退、脱发、白细胞减少、副作用明显，有恶心、食欲减退、脱发、白细胞减少、中毒性膀胱炎、肝功能损伤等中毒性膀胱炎、肝功能损伤等v具有显著的遗传、生殖毒性：停经或精子缺乏，妊娠初具有显著的遗传、生殖毒性：停经或精子缺乏，妊娠初期时给予可致畸胎期时给予可致畸胎￿ ￿v用药后用药后24-30小时，骨髓中微核形成达峰小时，骨髓中微核形成达峰9　结果示小鼠骨髓嗜多染示小鼠骨髓嗜多染红细胞中一个微核红细胞中一个微核示小鼠骨髓正常示小鼠骨髓正常嗜多染红细胞嗜多染红细胞10示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核11示小鼠骨髓嗜多染红细胞中多个微核示小鼠骨髓嗜多染红细胞中多个微核Giemsa染色•PCE胞质内含有核糖体，染色呈灰蓝色；MCN多数为圆形，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色•NCE的核糖体已消失，被染成淡桔红色NCE PCE & MCN实验目的1.用化疗药（环磷酰胺）制备突变模型2.观察小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核•【Animal】 小鼠是微核试验的常规动物，通常用7～12周龄，体重18～20g的小鼠•【Reagents 】 小牛血清 Giemsa染液 环磷酰胺实验动物及试剂实验分组和染毒方法环磷酰胺环磷酰胺40mg/kg 模型组模型组等体积溶剂等体积溶剂对照组对照组染毒方法（染毒方法（30h两次给药法）：两次给受两次给药法）：两次给受试物间隔试物间隔24h，第二次给药后，第二次给药后6h取材取材处死处死：小鼠颈椎脱臼处死；：小鼠颈椎脱臼处死；取股骨取股骨：防止出血；：防止出血；取骨髓取骨髓：小牛血清：小牛血清1滴滴推片推片：：30度角；度角；晾干晾干：一定要干；：一定要干；固定固定：甲醇固定：甲醇固定10min, 需要晾干；需要晾干；染色染色：：Gimesa染液染色（染液染色（10~15min））冲洗：冲洗：蒸馏水冲洗，晾干蒸馏水冲洗，晾干阅片阅片: 观察微核。

观察微核￿染染染染毒毒毒毒后后后后操操操操 作作作作步步步步骤骤骤骤推 片 方 法观察与计数：低倍镜下选择分布均匀，染色较好的区域 油镜下观察计数F多染红细胞（PCE）呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）呈橘黄色典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色 F计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值微核率（微核率（‰））=含微核含微核PCE细胞细胞数数PCE细胞总数细胞总数×1000实验方法和步骤实验结果组别动物数物数受受检PCEPCE总数数含微核含微核PCEPCE数数微核率微核率阴性阴性对照照组模型模型组结果分析与评价•本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示.•PCE/NCE为评价细胞毒性的指标：F正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.6～1.2)；F如PCE/NCE＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制；F如PCE/NCE＜0.05，则表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。