CRISPR-Cas9精细原理：基因敲除、点突变、基因插入课件.ppt

CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9大全：大全：基因敲除、点突变、基因插入基因敲除、点突变、基因插入2015-10-15pCRISPR-CasCRISPR-Cas系统简介系统简介pCRISPR-CasCRISPR-Cas系统的应用技术系统的应用技术pCRISPR-CasCRISPR-Cas系统的应用前景系统的应用前景contentscontents1.￿CRISPR-Cas系统简介系统简介1.1 CRISPR-Cas系统的研究历史系统的研究历史p1987 年，日本课题组在年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年，年，正式将其命名为正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文成簇的规律间隔的短回文重复序列重复序列p2005 年发现年发现CRISPR 的间隔序列的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的系统可能以类似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。

方式抵抗外源遗传物质的入侵p2007 年，年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入系统抵抗噬菌体入侵；侵；2008 年，年，Marraffini 等发现细菌等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转移，系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能系统的功能p2013 年初，年初，MIT 的研究组首次利用的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人系统对人293T 细胞细胞EMX1 和和PVALB 基因以及小鼠基因以及小鼠Nero2A 细胞细胞Th 基因实现了定点突变同基因实现了定点突变同年年Mali 利用利用CRISPR/ Cas9 在人在人293T 细胞和细胞和K652 细胞基因的靶位点形成细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定修复机制高效介导外源基因定点插入 1.2CRISPR-Cas系统的结构系统的结构pCRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。

CasCas蛋白是一种双链蛋白是一种双链DNADNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNAguide RNA引导下对靶位点进行切割它引导下对靶位点进行切割它与与folkfolk酶功能类似，但是它并不需要形成酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用二聚体才能发挥作用1.3 CRISPR-CAS 1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理系统的作用机理p CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM（NGG序列），将临近 PAM 的序列作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5'端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间1.3 CRISPR-CAS 1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理系统的作用机理p CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工) 当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR 簇首先转录为长的crRNA前体，然后逐步被加工成小的成熟的crRNApCRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰 crRNA 结合相关的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合，随后Cas 蛋白对目标DNA 进行断裂和降解。

1.3 CRISPR-CAS 1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理系统的作用机理2 2、、CRISPR-CasCRISPR-Cas系统的应用系统的应用2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑介导的基因组精确编辑技术技术p基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术p这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的p通过修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因p基因组编辑是研究基因功能的重要手基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为现代分子的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点生物学的研究热点2.1 2.1 CRISPR-CasCRISPR-Cas9 9介导的基因组精确编辑技术介导的基因组精确编辑技术 CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术 Mali 等人 利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的CRISPR 相关蛋白Cas9，在一段人为重组的sgRNA( small-guide RNA) 的引导下，针对小鼠和人类基因组的特定基因片段实现了精确的剪切。

这种通过可编程RNA 进行DNA 改造的技术为基因组编辑开创了一条新的途径例子：基因敲除的实验过程1、在把基因序列中寻找NGG序列获得其附近20多个碱基的序列，与tracrRNA序列融合，设计出sgRNA并合成该序列2、将该序列以及cas9基因连入如图所示载体3、转化感受态，质粒小提，测序验证4、细胞培养与细胞转染5、敲除效果检测6、建立稳定敲除的细胞株2.2CRISPR/Cas92.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活介导的转录抑制与转录激活p在在CRISPR/Cas9的的Ⅱ型系统中将型系统中将Cas9中的切割域突变，会使中的切割域突变，会使Cas9蛋白蛋白失去对ＤＮＡ的切割活性，但不影响其与ＤＮＡ失去对ＤＮＡ的切割活性，但不影响其与ＤＮＡ 结合的能力结合的能力这种失去ＤＮＡ切割活性的去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名为蛋白被命名为Dead ＣＣas9将ｄCas9与与gRNA在细胞中共表达，则在细胞中共表达，则gRNA可以介导ｄ可以介导ｄCas9蛋白与ＤＮＡ蛋白与ＤＮＡ 结合如果ｄ如果ｄCas9结合到靶基因的阅读框内，可阻断结合到靶基因的阅读框内，可阻断RNA聚合酶的延伸作用；聚合酶的延伸作用；如果ｄ如果ｄCas9结合到靶基因的启动子区域则可阻止基因转录的起始结合到靶基因的启动子区域则可阻止基因转录的起始2.2CRISPR/Cas92.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活介导的转录抑制与转录激活pCRISPR／Cas9系统用于转录抑制需要PAM（３bp）和至少12bp的gRNA－ＤＮＡ配对p利用crＲＮＡ介导dCas9能够精确识别靶基因的特点，将ｄCas蛋白与具有转录激活的蛋白质功能域融合则可构建具有转录激活活性的CRISPR－on系统。

p真核细胞的转录激活因子可通过将ｄCas9与单纯疱疹病毒转录激活子ＶＰ16结合获得3 3、、CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9技术的优势与前景技术的优势与前景3.1CRISPR-Cas93.1CRISPR-Cas9技术的优势技术的优势p而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行p只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性p编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单方便p较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来的并发症。