琼脂糖电泳步骤.docx

琼脂糖电泳步骤之超级基础篇步骤如下：1. 制备1%琼脂糖凝胶（大胶用70ml,小胶用50ml）:称取0.7 g（0.5 g）琼脂糖置于锥形瓶中，加 入70 ml（50ml）1XTAE,瓶口倒扣小烧杯•微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成 1.0% 琼脂糖凝胶液 .2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带 将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷 却到65°C左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻 璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内 槽放入电泳槽中.添加1 XTAE电泳缓冲液至没过胶板为止.3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应 不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一 个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.（注意:加样前要先记下加样的顺序）.4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V,样品由负极（黑色）向正极（红色）方 向移动.电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1cm 处 时，停止电泳.⑸电泳完毕后，取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1XTAE溶液染色约20 min,再用清水 漂洗 10 min.（6）观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存.Gold View I型核酸染色剂目录号 规格G8140 1.0ml产品介绍：Gold View是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型DNA染料，其灵敏度与EB相当，使用方 法与之完全相同。

在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈红色荧光通过小 鼠皮下注射试验，尚未发现Gold View有致癌作用，而溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂 因此用Gold View代替EB不失为一种明智的选择实验操作步骤：100ml溶胶液在微波炉中融化，冷却至60C左右（不烫手）后加入10vl Gold View,轻轻摇 匀后倒胶，待胶完全凝固后上样电泳，电泳完毕在紫外灯下观察使用方法：将 100ml 琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为 0.8%~2%）在微波炉中融化加入5-10卩l GoldenView （如果背景过高可以适当减少用量，如果敏感度过低，可以适当增 加用量），轻轻摇匀，避免产生气泡冷却至不烫手时倒胶，待琼脂糖凝胶完全凝固后上样电泳 电泳完毕在紫外灯下观察若使用数码相机照像记录，则关闭相机的闪光灯，放在自动档即 可；若使用凝胶成像系统照相，通过调节光圈、曝光时间，选择合适的滤光片，可得到成像 清晰、背景较低的照片v 注意事项1. 胶厚度不宜超过0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度2. 加入GoldenView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响，但不 明显3. 通过凝胶电泳回收DNA片段时，建议使用GoldenView染色，在自然光下切割DNA条 带，避免紫外线与EB对目的DNA产生的损伤，可明显提高克隆、转化、转录等分子生物 学下游操作的效率。

4. 虽然未发现GoldenView有致癌作用，但是各种核酸染料的致癌作用学术界一直存在争议, 同时GoldenView对皮肤、眼睛会有一定的刺激，为安全起见，我们强烈建议操作时依然应 该每次带手套，不小心接触皮肤后应该立刻清洗，并妥善处理废弃物注意事项：1. 胶厚度不要超过0.5cm，胶太厚会影响检测灵敏度2. 加入Gold View的琼脂样凝胶反复融化可能会对DNA检测的灵敏度产生一定影响， 但不明显3. Gold View在PH 3.6-7.0之间能更好的与核酸结合，因此电泳时最好使用新鲜的电泳 缓冲液4. 由于Gold Mew产生绿色荧光，因此不适合于用一般单色胶卷拍照，可以使用凝胶成 像系统保存图像5. 含有Gold View的凝胶不适合于进行凝胶回收试验要进行回收试验，请使用EB胶 或 SYBR Green I 型核酸染色剂6. Gold Mew特别适合于大片段DNA的检测（大于lkb的片段，检测灵敏度与EB相当）； 当DNA片段小于lkb时，检测灵敏度低于EB,特别是低于500bp的片段，Gold Viewl型 可能亮度很弱或者检测不到，如要检测小片段的DNA，请选用SYBRGreen I型核酸染色剂, 该染色剂适合检测所有片段大小的DNA片段。

7. 虽然尚未发现Gold Mew有致癌作用，但由于Gold Mew溶液酸性较强，因此对皮肤, 眼睛会有一定的刺激，操作时应戴手套应用特点：快速：整个操作过程可在几分钟内完成，方便使用高效：Gold View可以检测50ng级的DNA或者RNA片段其激发波长有多处，其中两处 最强：230nm和490nm,客户可以调整紫外波长增强其荧光强度 方便：此试剂即开即用，使用方便安全：尚未发现Gold View有致癌作用，使用该试剂不用接触EB （溴化乙锭）等有害物质、电泳前准备准备内容作用1•刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏 水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染梳 子干净有利于梳孔的形成2.检查电泳槽，根据情况更换buffer排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓 冲能力，减少污染3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并 记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者 是过慢浪费时间4.计算agarose的用里和制胶buffer的用里记 录，胶最终越薄越好实验记录备查、制胶步骤注意事项1.称量 agarose 和 bufferBuffer不要用成H2O,称量相对准确2•融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇 匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热 到沸腾。

非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使 （胶冲出瓶子因此注意选择起码为胶体积2倍 以上的瓶子保证胶混匀和完全溶解，减少可 能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左 右，即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的 一侧，缓缓地一次性倒入梳子最好是预先放 好并固定的，注意梳孔的体积能点的下所有的 样用枪头赶掉气泡制胶的桌面相对水平倒胶时尽量减少气泡的 产生EB如果在制胶时加入，在60度左右时 加入，使终浓度为0.5ug/m 1不宜过低，染色 成像不明显；不宜过咼，导致背景太深摇匀 要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能 性高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀， 而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后 再用EB染色4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移 动时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过 短，影响胶内部孔径形成5.拔梳子，放入电泳槽缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子 是同时从各个胶孔拔出的暂时不用的胶最好 放入电泳槽电泳液中浸泡电泳液要浸没胶 1mm三、上样电泳步骤注意事项1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X,混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不 能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易 形成带形的变形。

注意混匀2•点样沿着胶孔的边缘匀速加入尽量避免碰坏胶 孔枪头不要吸过多的气泡，拔起时不要过猛 带出样品每点一个样完，吸取buffer洗枪头, 避免样品混杂如果是有特殊要求，例如回收， 强烈建议每点一个样换一次枪头加样的速度 当然是越快越好，注意保证质量点样的量不 要太大，一方面是体积不要太大，溢出污染邻 位样品；一方面两不要太大，容易导致脱尾和 模糊不清3.接通电源，选择合适的电压和时间电泳胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪跑胶 期间不时回来看看，防止样品跑出胶等意外发 生四、染色成像步骤注意事项1•染色如果胶中没有加入EB,用0.5ug/m1的EB溶 液浸染30分钟2.调整镜头的拍摄范围和焦距，成像。