pcr扩增的原理和步骤.docx

PCR技术的原理与反应步骤20世纪70年代末，随着DNA重组技术的产生和发展，如何快速获得目的基因（待检测 或待研究的特定基因）片段已经成为瓶颈问题1983年K.Mullis发明了聚合酶链反应（PCR） 技术该技术可将微量DNA片段大量扩增，使微量DNA或RNA的操作变得简单易行PCR技 术的高敏感、高特异、高产率、可重复、快速简便等优点使其迅速成为分子生物学研究中应 用最为广泛的方法，许多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决°PCR技术的发明是 分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展，成为分子生物 学与医学的支撑技术°PCR技术的发明者Kary Mullis为此获得了 1993年的诺贝尔化学奖近年来，PCR技术不断改进，从手工操作发展到自动化仪器，从定性分析发展到定量测 定该方法与其他分子生物学技术相结合，其用途日益广泛新的PCR技术类型层出不穷一、PCR技术的工作原理PCR的基本工作原理是在体外模拟体内DNA复制的过程以待扩增的DNA分子为模板， 用两条寡核苷酸片段作为引物，分别在拟扩增片段的DNA两侧与模板DNA链互补结合，提供 3'-0H末端；在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成两条 新链的合成。

不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增PCR反应的特异性依赖于 与模板DNA两端互补的寡核苷酸引物组成PCR反应体系的基本成分包括模板DNA、特异引 物、耐热性DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）、dNTP以及含有Mg2的缓冲液PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法每个PCR体系均包括4种主要成分：含有待 扩增序列的DNA模板、引物（primer）、TaqDNA聚合酶（TaqDNA polymerase）和脱氧核糖 核酸三磷酸（dNTP）PCR的基本反应步骤包括高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：① 高温变性：将反应体系加热至95r，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身 以及引物之间存在的局部双链也得以消除；② 低温退火：将温度下降至适宜温度（一般较Tm低5°C，约50-65°C），两条人工合成 的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链，使引物与模板DNA结合；③ 适温延伸：将温度升至TaqDNA聚合酶的最适温度72C，DNA聚合酶以引物3'端为合 成的起点，以单核苷酸dNTP为原料，沿模板以5'-3'方向延伸，催化DNA的合成反应，合 成DNA新链。

第1个伽环4 产生W十射退火；降湿以使引物P目的序列末端形(I变性：短祈加焦使UNA戏说解推的延伸：DNA聚合隋将核许酸加至一引物的3,末端第2个产生4个分子PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分在第一轮反应周期中，以两条互 补的DNA为模板，引物附上模板的3'-端，即新生链的5'-端是固定的，其3'-端则没有固 定的止点，产生“长产物片段”进入第二轮循环，新延伸片段的起点和终点都限定于引物 扩增序列以内，形成长短抑制的“短产物片段”短产物片段的长度严格地限定在两个引物 链5'-端之间，是需要扩增的特定片段短产物片段”按指数倍数增加，而“长产物片段” 几乎可以忽略不计这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两 条双链DNA分子如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每 一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增1倍，PCR产物得以2n的指数 形式迅速扩增，经过25-30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达 106~107倍与其他分子生物学技术相比，PCR具有效率高、敏感性高、特异性强、快速、简 便等优点；不足之处是需要严格的实验条件，如果使用不当，易有假阳性和假阴性。

实时荧光定量 PCR (real-time fluorescent quantitative PCR)技术是在 PCR 反应体 系中加入荧光试剂，利用PCR产物形成的荧光信号实时检测PCR进程，最后通过标准曲线对 未知模板进行定量分析的方法实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确 定量起始模板浓度二、PCR技术的主要用途(一) 获得目的基因片段PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法在人类基因组 计划完成之前，PCR是从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的新基因片段或新基因的 主要方法目前，该技术是从各种生物标本或基因工程载体中快速获得已知序列目的基因片 段的主要方法二） DNA和RNA的微量分析PCR技术敏感性高，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量定性和定量分析的最 好方法理论上讲，只要存在1分子的模板，就可以获得目的片段实际工作中，1滴血液、 1根毛发或1个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前 景三） DNA序列分析将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度，是实现高 通量DNA序列分析的基础。

待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接 测定四） 基因突变分析PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性，例如单链构象多态性分析、 等位基因特异的寡核苷酸探针分析、基因芯片技术、DNA序列分析等五） 基因的体外突变在PCR技术建立以前，在体外对基因进行各种突变是一项费时费力的工作现在，利用 PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行插入、嵌和、缺失、点突变等改造。