三阴性乳腺癌对多西他赛敏感性受BECN1影响的实验研究.docx

三阴性乳腺癌对多西他赛敏感性受BECN1影响的实验研究乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，是癌症相关性死亡的主要原因三阴性乳腺癌（Three-negativebreastcancer,TNBC）即雌激素受体（Estrogenreceptor,ER）和孕激素受体（Progesteronereceptor,PR），人表皮生长因子受体-2(Humanepidermalfactor2,HER-2）均阴性表达的乳腺癌[1]TNBC占女性乳腺癌的15%～20%，此类乳腺癌具有较高的侵袭性，预后极差[2]因TNBC缺乏相关受体，无法针对性使用内分泌药物及分子靶向药物等，药物治疗仍停留在细胞毒性药物的使用，治疗效果不理想[3]为此，为TNBC寻找有效的新的治疗方法显得极为迫切[4]BECN1是哺乳动物的特异性自噬基因，其与酵母自噬相关基因6(Autophagyassociatedgene,ATG6）同源，与吞噬泡的形成相关，位于人类染色体17q21[5]BECN1通过促进吞噬泡的形成和成熟，促进自噬水平[6]本课题组的前期研究发现，隐丹参酮作用于MDA-MB-231细胞后，可促进BECN1的表达和LC3B蛋白的转化，促进细胞自噬[7]，该结果可能导致MDA-MB-231细胞对隐丹参酮产生耐药。

有研究表明[8,9]，在乳腺癌中，自噬的上调可允许肿瘤细胞在治疗引起的应激中存活，从而促进耐药的发生肿瘤细胞在放化疗后，其内部会产生大量破损的细胞器、蛋白等对细胞不利的成分，而BECN1等调控的自噬可以保护肿瘤细胞免受抗肿瘤治疗的影响，并提供应急的底物及能量，为肿瘤细胞的修复赢得时间和条件[10]Tai等[11]早期研究也发现自噬可以促进肺腺癌细胞对多西他赛的抵抗性，降低其敏感性相反，通过氯喹抑制细胞自噬可增强皮肤鳞状细胞癌对多西他赛的敏感性[12]因此，BECN1与肿瘤化疗耐药关系密切但对于TNBC，此方面的报道极少，BECN1与肿瘤细胞的化疗抵抗关系仍未明了针对三阴性乳腺癌的难治性，BECN1能否作为TNBC治疗中抵抗化疗耐药的新靶点，具有较高的研究价值本实验中，笔者通过RNA干扰沉默BECN1基因，多西他赛处理转染前后各组细胞，初步探讨沉默BECN1后，三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞对多西他赛敏感性变化，为BECN1靶点应用于TNBC防治提供理论依据1、材料与方法1.1试剂多西他赛（生产批号：D1930061，美国阿拉丁公司）；DMEM高糖培养基、胰酶、青—链霉素双抗（美国GIBCO公司）；胎牛血清（以色列BiologicalIndustries公司）、总RNA提取试剂盒、反转录第一链cDNA合成试剂盒、FastStartUniversalSYBRGreenMaster、PCR引物（日本TAKARA公司）、兔抗人BECN-1单克隆抗体、兔抗人LC3B单克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）、Annexinv/7-aad细胞凋亡检测试剂盒（美国ThermoScientific）、CCK-8(日本同仁)。

1.2细胞系人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞购自procell公司（含STR鉴定证书）；BECN1干扰慢病毒由上海吉玛生物公司代为构建、包装1.3方法1.3.1细胞培养人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞使用含有10%FBS、100U/L青霉素及100μg/L链霉素的高糖DMEM培养基于37℃含5%CO2胞培养箱中培养1.3.2细胞分组与转染MDA-MB-231细胞分为空白组、NC组及干扰组培养细胞使其融合度达50%至70%时，按照感染复数（MOI)=10,NC组与干扰组分别使用含有阴性对照慢病毒、BECN1干扰慢病毒的完全培养基培养进行转染处理，72h后于荧光显微镜下观察细胞发光情况，之后予以嘌呤霉素持续筛选一周，以获得稳定转染的细胞株1.3.3实时荧光定量PCR检测各组细胞BECN1mRNA的表达取培养至融合度80%～90%处于对数期的各组细胞，提取其总RNA，检测纯度及浓度，逆转录合成cDNA，在steponeplus荧光定量PCR仪上进行PCR反应，反应条件：预变性，95℃，30s(1个循环）；变性，95℃，5s；退火及延伸，60℃，30s（共40个循环）根据反应CT值，采用2-△△CT法计算各组细胞BECN1mRNA的相对表达量。

1.3.4蛋白免疫印迹反应（Westernblot,WB）检测各组细胞BECN1蛋白的表达PBS清洗各组细胞后，各组细胞分别加入300至500μL含PMSF的高效裂解液于冰上裂解30min，收集裂解液至1.5mLEP管中，4℃，12000～14000r/min离心5min，取上清液即为所提取的细胞总蛋白BCA法测各组总蛋白浓度SDS-PAGE凝胶电泳（80V/120V），将蛋白条带湿转法转至PVDF膜（110mA,120min）,封闭液封闭5min,TBST洗膜3次（5min/次），一抗4℃孵育8h或过夜，TBST洗膜3次（5min/次），二抗室温孵育2h,TBST洗膜3次（5min/次），ECL发光，用FCQ凝胶图像分析系统扫膜及分析条带灰度值，以BECN1蛋白条带灰度值与GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示BECN1的相对表达量1.3.5CCK-8法检测多西他赛对各组细胞处理后的半抑制浓度（IC50）取生长状态良好、无污染的处于对数期的各组细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，用完全培养基将细胞密度调为5×105个/mL分别将上述各组细胞接种于96孔板，每孔接种100μL，即每孔接种50000个细胞。

细胞贴壁后，吸弃旧培养基，并分别加入含不同浓度多西他赛（0.0008μg/mL、0.004μg/mL、0.02μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL）的完全培养基，每个浓度设置6个复孔，并设置空白孔和对照孔，将各组细胞置于37℃，5%CO2培养箱继续培养48h分别将各组细胞置于酶标仪上，在450nm波长处测量各孔的吸光度值（OD值），计算不同浓度多西他赛作用下，各组细胞的增殖抑制率计算公式：细胞增殖抑制率=[（Ac-As)/（AcAb）]×100%其中，As:实验孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8和多西他赛）；Ac：对照孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8溶液、不含多西他赛）；Ab：空白孔吸光度（含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、多西他赛）1.3.6流式细胞术检测各组细胞凋亡率将生长状态良好、处对数期无污染的各组细胞分别接种于6孔板，并设置另外个孔常规培养正常的MDA-MB-231细胞，用于调机除了调机孔，其余细胞均使用含多西他赛0.1μg/mL的完全培养基培养培养48h后使用不含EDTA的胰酶消化细胞，用预冷的PBS清洗2次，再用1mL1×的BindingBuffer悬浮细胞，300g离心10min，弃上清。

用1mL1×的BindingBuffer重悬细胞，使细胞密度达到1×106个/mL分别在EP管中加入100μL各组细胞悬液，再向管中加入5uLAnnexinV-FITC，室温避光下轻轻混匀10min加入5uL7-AAD，室温，避光，孵育5min加入PBS至总体积为500μL，轻轻混匀在1h内用流式细胞仪检测，取流式散点图的右上、右下象限作为总细胞凋亡率1.4统计学方法采用SPSS26.0统计软件分析数据，符合正态分布计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义2、结果2.1慢病毒感染MDA-MB-231细胞的效率以BECN1干扰慢病毒和空载慢病毒分别感染MDA-MB-231细胞72h后，置于倒置荧光显微镜下观察，明、暗视野对比，干扰组和NC组慢病毒感染效率均达95%以上，见图1图1慢病毒感染效率评价（×100)图1慢病毒感染效率评价（×100)下载原图2.23组细胞BECN1mRNA的相对表达量比较荧光定量PCR实验结果显示，空白组、NC组及干扰组BECN1mRNA的相对表达量分别为（1.00±0.06）、（0.98±0.03）和（0.11±0.01），干扰组BECN1mRNA的相对表达量低于空白组和NC组，差异有统计学意义（P<0.05）；空白组和NC组BECN1mRNA相对表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

见图2、图3图2PCR扩增曲线图3各组细胞BECN1mRNA表达水平柱状图2.3三组细胞BECN1蛋白的相对表达量比较干扰组BECN1蛋白的相对表达量低于空白组和NC组，差异有统计学意义（P<0.05）；空白组和NC组BECN1蛋白的相对表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）见图4，图52.43组细胞多西他赛IC50比较空白组、NC组和干扰组IC50分别为（0.09±0.00）μg/mL、（0.09±0.01）μg/mL、（0.05±0.01）μg/mL，干扰组细胞多西他赛IC50低于空白组及NC组，差异有统计学意义(P<0.05)多西他赛呈浓度依赖性抑制MDA-MB-231细胞的增殖，在同一浓度下，干扰组细胞增殖抑制率高于空白组及NC组，差异有统计学意义（P<0.05），见表12.53组细胞凋亡率比较多西他赛处理48h后，干扰组细胞凋亡率低于空白组和NC组，，差异有统计学意义（P<0.05）；空白组和NC组比较，差异无统计学意义（P>0.05）见图6，图7图4各组细胞BECN1蛋白的表达图5各组细胞BECN1蛋白表达柱状图表1多西他赛对各组细胞的生长抑制率与空白组及阴性对照组比较，*P<0.05。

图6多西他赛对各组细胞凋亡率的影响图7各组细胞凋亡柱状图3、讨论TNBC恶性程度高，早期易转移，目前TNBC在药物治疗方面，主要以紫杉类、蒽环类及铂类药物的系统性化疗为主[3,13]微管是真核细胞的组成成分之一，在肿瘤细胞中，微管和微管蛋白二聚体之间存在着动态平衡多西他赛可打破微管和微管蛋白二聚体间的这种动态平衡状态，其主要机制是诱导并促进微管蛋白聚合的发生，导致肿瘤细胞在进行有丝分裂时无法形成纺锤体和纺锤丝，使肿瘤细胞的分裂、增殖受到抑制[14]，蒽环类药物则抑制肿瘤细胞DNA复制及RNA合成，阻止肿瘤细胞分裂和增殖受细胞BECN1调控的自噬等多种耐药机制的影响，TNBC患者对该系统性化疗的敏感性大为降低BECN1与多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关[15,16]，在肿瘤化疗治疗的过程中，一方面BECN1可通过促进过度自噬诱导肿瘤细胞凋亡，该过程被称作细胞Ⅱ型程序性死亡，另一方面BECN1又能够促使肿瘤细胞产生保护性自噬，增强肿瘤细胞的耐药性[17],这种对立的作用使得肿瘤的化疗变的错综复杂本课题组前期研究也发现，当隐丹参酮作用于MDA-MB-231细胞后，可促进BECN1的表达和LC3B蛋白的转化，促进细胞自噬[7]。

据此，本实验通过RNA干扰沉默BECN1基因，多西他赛处理转染前后各组细胞，初步探讨沉默BECN1后，三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞对多西他赛敏感性变化本研究结果显示，细胞感染慢病毒后，其生长迅速，72h后于倒置荧光显微镜下可见细胞荧光发光率达95%以上，转染后细胞BECN1mRNA和BECN1蛋白的表达均显著降低，BECN1沉默效率达89.9%，提示转染成功CCK-8实验结果发现，多西他赛呈浓度依赖性抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，且通过RNA干扰沉默BECN1基因后，该增殖抑制作用被显著提高，显示出该三阴性乳腺癌细胞对多西他赛的敏感性增强但流式细胞术实验结果则显示，当沉默BECN1基因后，多西他赛致MDA-MB-231细胞凋亡的效果会被减弱。