第4章荧光分析法.ppt

荧光分析法荧光分析法 药物分析教研室药物分析教研室1 第一节 基本原理 第二节 定量分析方法 第三节 荧光分光光度计与新技术 第四节 应用与示例2相关定义相关定义(一一)u荧光荧光 物质分子吸收光子能量而被激发，物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动能级返回到然后从激发态的最低振动能级返回到基态时所发射出的光基态时所发射出的光u荧光分析法荧光分析法 根据物质的荧光谱线位置及强根据物质的荧光谱线位置及强度进行物质鉴定和物质含量测定的方度进行物质鉴定和物质含量测定的方法法 3相关定义相关定义(二二)u分子分子紫外紫外- -可见可见荧光分析法荧光分析法 有些物质的分子，在用紫外有些物质的分子，在用紫外- -可见可见光激发时，能发射荧光，由此建立光激发时，能发射荧光，由此建立的方法4优优 点点 u灵敏度高：灵敏度高：检出限可达检出限可达10-10~10-12g/mlu选择性好选择性好5FL与与UV比较比较(一一) u相同点相同点 •λ区段区段：：Vis-UV区区 •适用性适用性：均可用于定性定量，：均可用于定性定量， 多用于定量多用于定量 •定量方法定量方法：相似：相似•样品性质样品性质: 以液体为主以液体为主•用用 量量：均少：均少•分析时间分析时间：均快：均快•操作难易程度操作难易程度：易：易6FL与与UV比较比较(二二)u不同点不同点 UV FL性性 质质 分子吸收光谱分子吸收光谱 分子荧光光谱分子荧光光谱 应用范围应用范围 广广 荧光的物质，较少荧光的物质，较少 选择性选择性 不高不高 高高灵敏度灵敏度 g/ml10-7 10-10~10-12仪器观察角度仪器观察角度 透射光透射光 90° 谱线数目谱线数目 127第1节 基本原理u分子荧光的产生分子荧光的产生u激发光谱与荧光光谱激发光谱与荧光光谱u荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系8荧光和磷光产生示意图荧光和磷光产生示意图9二、激发光谱与 发射光谱u定定 义义激发激发λ,ε荧光荧光λ图形图形激发光谱激发光谱 变变不变不变F~λex图图发射光谱发射光谱 不变不变变变F~λem图图10硫酸奎宁的激发光谱硫酸奎宁的激发光谱a 及荧光光谱及荧光光谱b11激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱u特点特点•荧光光谱形状与荧光光谱形状与λλexex无关无关•荧光光谱与激发光谱互为镜像荧光光谱与激发光谱互为镜像•斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发光波长的现象。

12蒽的激发光谱及荧光光谱蒽的激发光谱及荧光光谱13蒽的能级跃迁蒽的能级跃迁14 三、荧光与分子结构（一）荧光效率（一）荧光效率（二）荧光与分子结构的关系（二）荧光与分子结构的关系15u荧光效率荧光效率 激发态分子发射荧光的光子数与基态分子激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用吸收激发光的光子数之比，常用φf表示：表示： φf = 发射荧光的光子数发射荧光的光子数 吸收激发光的光子数吸收激发光的光子数 φf (0~1) φf 大的有荧光发射大的有荧光发射（一）荧光效率（一）荧光效率16二、荧光与二、荧光与 分子结构分子结构的关系的关系u产生荧光的两个条件：产生荧光的两个条件：•强紫外强紫外- -可见吸收可见吸收 共轭的共轭的π→π*跃迁跃迁•一定的荧光效率一定的荧光效率17u影响影响荧光强度荧光强度因素（内部因素）因素（内部因素）•共轭效应共轭效应•分子的刚性与共平面性分子的刚性与共平面性•取代基效应取代基效应18共轭效应 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，因为芳香环或杂环分子具有长共或杂环，因为芳香环或杂环分子具有长共轭的轭的π→π*跃迁。

跃迁π电子共轭程度越大，电子共轭程度越大，荧光强度（荧光效率）越大，而荧光波长荧光强度（荧光效率）越大，而荧光波长也长移 19 苯 萘 蒽 λ ex 205nm 268nm 356nmλ em 278nm 321nm 404nm φf 0.11 0.29 0.3620分子的刚性与共平面性 在同样的长共轭分子中，分子的刚性在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越大，荧光率越大，并和共平面性越大，荧光率越大，并且荧光波长产生长移且荧光波长产生长移 21取代基效应第一类取代基：第一类取代基：－－NH2、－、－OH、－、－OCH3、－、－NHR、、－－NR2、－、－CN等等第二类基团：－第二类基团：－COOH、－、－NO2、－、－C＝＝O、－、－NO、、－－SH、－、－NHCOCH3、－、－F、－、－Cl、－、－Br、－、－I等等第三类取代基：－第三类取代基：－R、－、－SO3H、－、－NH3＋＋等等22四、影响荧光强度的四、影响荧光强度的 外部因素外部因素•温度：温度升高，荧光物质的荧光效率和荧光强度下降•溶剂：溶剂极性增大，荧光波长随着而长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小，荧光强度减小23影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素•pH值的影响：当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的荧光强度有较大影响，这主要是因为弱酸弱碱分子和它们的离子结构有所不同，在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，因此荧光强度有差异24苯胺在不同苯胺在不同pH值下有下列平衡关系值下有下列平衡关系 苯胺在苯胺在pH7～～12的溶液中主要以分子形式存在，的溶液中主要以分子形式存在，由于由于-NH2为提高荧光效率的取代基，故苯胺分子为提高荧光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。

但在会发生蓝色荧光但在pH<2和和pH>13的溶液中均的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光25影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素•荧光猝灭剂：荧光猝灭剂：Ø荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象降低的现象Ø引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂Ø荧光猝灭的形式：荧光猝灭的形式： a、、碰撞碰撞 b、、生成不发光配位化合物生成不发光配位化合物 c、、荧光物质氧化荧光物质氧化26常见的荧光熄灭剂卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物27影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素•散射光的影响：散射光的影响：Ø瑞利散射光Ø拉曼散射光干扰荧光测定，应采取措施消除干扰荧光测定，应采取措施消除28硫酸奎宁在不同波长激发下的硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱荧光与散射光谱 29第第2节节 定量分析方法定量分析方法 (一)荧光强度 与物质浓度的关系 (二)定量分析方法 30溶液的荧光溶液的荧光( (一一) )荧光强度与荧光强度与 浓度的关系浓度的关系31 ( (一一) )荧光强度与荧光强度与 浓度的关系浓度的关系32 ( (二二) )定量分析方法定量分析方法 1.标准曲线法标准曲线法 2.比例法比例法 3.多组分混合物的荧光分析多组分混合物的荧光分析33 •定性分析定性分析•依据依据：： 激发光谱 特征光谱 荧光光谱•方法：方法： 对照品对照34第第3节节 荧光分光光度计与新技术荧光分光光度计与新技术u荧光分光光度计由激发光源、激发单色器和发射单色器、样品池、检测器及读出系统组成 一、荧光分光光度计组成35 荧光分光光度机结构示意图荧光分光光度机结构示意图36激发光源•高压氙灯高压氙灯 ——强谱线的连续光谱强谱线的连续光谱 连续分布在连续分布在250~700nm波长范围内，波长范围内，尤其是尤其是300~400nm波长之间的谱线强波长之间的谱线强度几乎相等度几乎相等•汞灯汞灯 ——线光谱线光谱Ø高压：近紫外区高压：近紫外区365nm,398nm，，405nm，，436nm，，546nm，，579nmØ低压低压:紫外区，最强紫外区，最强254nm37单色器•激发单色器激发单色器 ------除去不需要的光线除去不需要的光线•发射单色器发射单色器 ------选择不同的荧光发射选择不同的荧光发射波长波长38样品池•低荧光的低荧光的玻璃玻璃或或石英石英，，方形适用于方形适用于90°测量测量39检测器•光电倍增管光电倍增管40读出系统•数字电压表数字电压表•记录仪记录仪•微机微机41二、荧光分析新技术简介•激光荧光分析•时间分辨荧光分析•同步荧光分析42第第4 4节节 应用示例应用示例一、无机化合物的荧光分析一、无机化合物的荧光分析•直接法直接法•生产金属配合物生产金属配合物•荧光猝灭法荧光猝灭法43二、有机化合物的荧光分析二、有机化合物的荧光分析制备荧光衍生物44荧光分析法在药物研究中的应用荧光分析法在药物研究中的应用•直接荧光法直接荧光法•制备荧光衍生物制备荧光衍生物•荧光熄灭法荧光熄灭法•胶束增敏荧光分析法胶束增敏荧光分析法45。