2005年版药典三部部分附录.doc

2005年版药典三部局部附录1．无菌检查法〔修订〕2．支原体检查法〔增修〕3．病毒外源因子检查法〔修订〕4．热原质检查法〔修订〕5．细菌内毒素检查法〔修订〕6．崩解时限检查法〔新增〕7．融变时限检查法〔新增〕8．最低装量检查法 〔新增〕9．装量〔片重〕差异检查法〔新增〕10．粒度检查法 〔新增〕11．抗毒素F〔ab〕2测定法〔修订〕12．絮状单位测定法〔新增〕13．A群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖分子大小测定法〔增修〕14．伤寒Vi多糖分子量大小测定法〔新增〕15．乙醇残留量测定法〔康卫氏扩散皿法〕〔新增〕16．蛋白质含量测定〔双缩脲法〕〔新增〕无菌检查法无菌检查法系指用微生物培养法检查生物制品是否无菌的一种方法无菌检查应在洁净度为10000级环境中的局部洁净度100级、单向流空气区域内或无菌隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染单向流空气区、工作台面及无菌隔离系统必须进行洁净度验证各种生物制品的无菌检查，均应按照本附录的规定进行，有专门规定者除外1 仪器1.1 取样用灭菌注射器，5、10ml(供直接接种法用)μm，膜直径约50mm 〔供薄膜过滤法用〕1.3 普通显微镜〔细菌镜检用〕。

2 培养基及其制备方法培养基应适合需氧菌、厌氧菌或真菌的生长，可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的干粉培养基2.1 需氧菌、厌氧菌培养基1〔流体硫乙醇酸盐1，用于培养需氧菌、厌氧菌〕胰酪蛋白胨(或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg) 15g酵母浸出粉(或酵母透析液200ml) 5g葡萄糖 5g硫乙醇酸钠(或硫乙醇酸) 0.5g〔0.3ml〕水 1000ml±0.2在供试品接种前，培养基氧化层的颜色〔红色〕不得超过培养基深度的1/3，否那么，须经水浴煮沸加热20分钟，迅速冷却只限加热一次，并防止被污染2.2 需氧菌、厌氧菌培养基2 (流体硫乙醇酸盐培养基2)按需氧菌、厌氧菌培养基1处方，删除琼脂，取其余成分，如法配制，即得2.3改进马丁培养基〔用于培养需氧菌、真菌〕蛋白胨 5g 酵母浸出粉 (或酵母透析液200ml) 2g葡萄糖 20g 磷酸氢二钾 1g硫酸镁 (MgSO4 •7H2O) 0.5g 水 1000 ml0.1%虎红 2 ml±0.22.4 营养琼脂培养基蛋白胨 10g牛肉浸粉 5g氯化钠 5g琼脂 14g水 1000ml±0.2上述培养基一般分别按10 ml、40 ml、100 ml或200 ml分装于试管或其他容器中，装量为试管或容器高度的2/5，均以115℃灭菌30分钟。

细菌培养基经30-35℃培养3天，改进马丁培养基经20-25℃培养3-5天后，应无菌生长合格的培养基使用期限不得超过一周3 培养基灵敏度检查3．1 菌种 由国家药品检定机构分发3.1.1 需氧菌 乙型溶血性链球菌(CMCC 32210株)，短芽孢杆菌(7316株)3.1.2 厌氧菌 生孢子梭状芽孢杆菌(CMCC 64941株)3.1.3 真菌、白色念珠菌〔ATCC 10231〕3．2 菌液制备将乙型溶血性链球菌、生孢子梭状芽孢杆菌、短芽孢杆菌分别接种于被检的培养基，经30～35℃培养一定时间 (乙型溶血性链球菌和生孢子梭状芽孢杆菌培养24～48小时，短芽孢杆菌培养18～20小时)后，将乙型溶血性链球菌和短芽孢杆菌分别刮入0.9%无菌氯化钠溶液内制成均匀菌液；生孢子梭状芽孢杆菌先将菌液吸入灭菌的试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌液；白色念珠菌接种在改进马丁培养基上，置20～25℃培养2-3天后，刮入0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌液再将以上菌液稀释至与标准比浊管〔由国家药品检定机构分发〕相同之浓度，然后用0.1%蛋白胨水作10倍系列稀释， 分别制成10-8乙型溶血性链球菌菌液，10-7的短芽孢杆菌菌液、10-7生孢子梭状芽孢杆菌菌液及10-6白色念珠菌菌液。

3.3 培养基接种将10-7的短芽孢杆菌、10-7生孢子梭状芽孢杆菌、10-8乙型溶血性链球菌和10-6 白色念珠菌菌液各1 ml分别接种到每管9 ml被检培养基中，(用于厌氧菌的培养基在试管中装量高度不得低于7cm)每种菌液至少接种3管，并用未接种的培养基做对照，将接种乙型溶血性链球菌、生孢子梭状芽孢杆菌的培养基置30～35℃培养3天，接种短芽孢杆菌的培养基置30～35℃培养5天，接种白色念珠菌的培养基置20～25℃培养5天，记录结果3.4 结果判定接种后培养基管数有2/3以上呈现生长，那么判为该培养基的灵敏度合格培养基灵敏度：乙型溶血性链球菌(32210株)应到达10-8，短芽孢杆菌(7316株)和生孢子梭状芽孢杆菌(64941株)应到达10-7，白色念珠菌〔ATCC 10231 株〕应到达10-63．5 附注3.5.1 不应在同一洁净室内同时操作两个菌株3.5.2 无菌检查用培养基应每批进行灵敏度检查，合格前方可使用3.5.3 各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌检查用培养基的灵敏度国家药品检定机构应定期抽检各生产单位的无菌检查用培养基4 各种培养基的采用4.1 检查需氧性和厌氧性杂菌，应采用流体硫乙醇酸盐培养基。

检查不含汞类防腐剂制品中的需氧性和厌氧性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐4.2 检查真菌和腐生菌时，应采用真菌培养基4.3 检查混浊制品时，可采用不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基检查活疫苗时，可适当增加琼脂含量，做成斜面5 抽样量及抽检瓶数5.1 原液及半成品除半成品除菌后需立即分装、留样作无菌检查的制品外，原液及半成品应每瓶〔罐〕分别进行无菌检查，其抽样量应至少为0.1%，但不得少于10ml原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验体外用诊断制品半成品每批取样至少3ml5.2 成品每亚批均应进行无菌检查，供试品应随机抽取，应具有代表性(包括分装过程的前、中、后供试品或冻干过程不同层冻干柜中的供试品)成品抽验量分出厂制品抽验量和上市制品监督抽验量两种5.2.1 出厂制品抽验量5.2.1.1 分装量在100支(瓶)或以下者抽检不少于5支，101～500支(瓶)者抽检不少于10支(瓶)，501～10000支(瓶)者抽检不少于20支(瓶)，10001支(瓶)以上者抽检40支(瓶)5.2.1.2 每瓶装量在20ml以上的冻干血液制品，每柜冻干200瓶以下者抽检2瓶，200瓶及以上者抽检4瓶每瓶装量6～20ml抽检数量加倍。

5ml和5ml以下者按5.2.1.1项抽检5.2.2 上市制品监督抽验量5.2.2.1 除血液制品外，其他生物制品每批抽检8支(瓶)5.2.2.2 血液制品每瓶装量在50ml以下，抽检6瓶，50ml或50ml以上抽2瓶　表 每支(瓶)注射剂抽验量 每支(瓶)制品装量 (ml) ＜0.5 ≤V＜5 5≤V＜20 20≤V＜100 每支(瓶)抽验量 (ml) 全量 0.5 1.0 5.0 6 检查法无菌检查法包括直接接种法及薄膜过滤法如供试品性状允许，可优先采用薄膜过滤法6．1 直接接种法6.1.1 含防腐剂的制品，应先增菌按5. 2项抽取的供试品按上表逐瓶取样，并按每20支安瓿混合后接种应接种培养基瓶数依供试品混合量〔全部接种〕而定接种量与培养基的比例：用苯酚或氯仿作防腐剂者至少为1∶20，用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为1∶50将混合供试品先按此比例接种于流体硫乙醇酸盐培养基1 内增菌，增菌培养基不得少于200ml〔扁瓶〕于20～25℃培养3～4天后移种至流体硫乙醇酸盐培养基1、适宜的营养琼脂斜面、改进马丁培养基各2管，每管0.5 ml将流体硫乙醇酸盐培养基1、适宜的营养琼脂斜面各1管置30～35℃培养，其余各管置20～25℃培养，增菌管及移种管培养时间全程不得少于14天。

6.1.2 不含防腐剂制品，不经增菌按5.2项及上表将每批〔或亚批〕抽检供试品逐瓶取样混合，装量在5.0ml以下者(包括5.0ml)每10瓶〔安瓿〕混合，装量在5.0ml以上者每7瓶〔安瓿〕混合，应接种培养基管数依供试品混合量〔全部接种〕而定将混合后的供试品直接接种于流体硫乙醇酸盐培养基1及改进马丁培养基培养基，接种后的流体硫乙醇酸盐培养基总数的1/2置30～35℃培养，其余置20～25℃培养，同时以0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品，做阴性对照，培养时间不得少于14天6.1.3 供试品混浊和接种后不能判定结果的制品，可按上表取规定量的供试品，接种于流体硫乙醇酸盐培养基2 (200ml)内进行增菌培养，3～4天后移种培养基种类和管数、培养温度同6.1.1项，增菌管及移种管培养时间全程不得少于14天，然后判定结果6.1.4 体外诊断制品只做半成品无菌检查即半成品在加防腐剂之前，除菌过滤时留样做无菌检查，用直接接种法，培养8天，观察结果如有菌生长，制品需经除菌处理后再做无菌检查，假设再有菌生长应废弃如半成品已参加防腐剂后除菌，那么应留样按含防腐剂制品用直接接种法作无菌检查6．2 薄膜过滤法μm，膜直径约50mm。

取规定抽检供试品数，〔如供试品少于10ml，那么先用100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液或无菌稀释液稀释，〕立即在无菌条件下导入无菌薄膜过滤器内，加压或减压过滤含汞类防腐剂的供试品，在供试品过滤后，用0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的无菌溶剂冲洗滤膜3次，每次100ml过滤后，两个滤器加流体硫乙醇酸盐培养基1 各100ml，另一个滤器加改进马丁培养基100ml一个硫乙醇酸盐培养基的滤器置30-35℃培养，其余置20-25℃培养，同时以0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品做阴性对照培养时间不少于14天6.3 结果判定6.3．1 无菌生长判为合格(有专门规定者除外)6.3.2 发现有菌生长，可复试复试供试品量应加倍，无菌生长判为合格假设复试仍有菌生长，该制品判为不合格6.3.3 成品无菌检查不合格的亚批数占整批的30%以上时，由质量保证部门会同有关部门根据具体情况，全部或局部废弃附注：冻干制品应按使用说明书或标签规定的溶解液重溶后进行无菌检查修订说明：此附录在现行版‘无菌试验规程’的根底上，参考?中国药典?‘无菌检查法’及WHO相关规程进行了修订，并对全文进行了重新组合原规程中‘支原体检查’局部另写成为独立的附录。

支原体检查本法系采用培养法和指示细胞法〔DNA染色法〕对主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查，上述两种方法应同时进行病毒类疫苗的病毒收获液、原液或成品的支原体检查采用培养法，必要时，亦可采用指示细胞法筛选培养基也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法1 培养法1． 1 仪器适宜规格的培养箱普通显微镜1．2 培养基种类及处方1．2．1 肺炎支原体肉汤培养基猪胃消化液 500ml牛肉浸液 500ml酵母浸粉 5 g葡萄糖 5g将上述成分混合溶解，于121℃高压灭菌15分钟使用时，于80ml内参加：无支原体马血清 20ml±1．2．2 精氨酸支原体肉汤培养基猪胃消化液 500ml牛肉浸液 500ml酵母浸粉 5 g葡萄糖 5gL-精氨酸 2g将上述成分混合溶解，于121℃高压灭菌15分钟使用时，于80ml内参加：。