酶工程实验.doc

实验 1、 大蒜细胞 SOD 的提取和分离一、原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的 SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8 磷酸缓冲液提取出由于 SOD 不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出二、材料和试剂1、新鲜蒜瓣2、0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）3、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:54、丙酮：用前需预冷至 4-10℃5、0.05mol/L 碳酸盐缓冲液（pH10.2）6、0.1mol/L EDTA 溶液7、2mmol/L 肾上腺素溶液三、步骤1、组织细胞破碎：称取 5g 大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨2、SOD 的提取：破碎后的组织中加入 2-3 倍体积的 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨 20min，使 SOD 充分溶解到缓冲液中，然后在 5000rpm下离心 15min，取上清液3、除杂蛋白：上清液加入 0.25 体积的氯仿-乙醇混合液搅拌 15min，5000rpm离心 15min，得到的上清液为粗酶液。

4、SOD 的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌 15min，5000rpm 离心 15min，得 SOD 沉淀将 SOD 沉淀溶于 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8 ）中，于 55-60℃热处理 15 min，得到 SOD 酶液5、SOD 活力测定将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的 SOD 活力试剂 空白管 对照管 样品管碳酸缓冲液 5.0 5.0 5.0EDTA 溶液 0.5 0.5 0.5蒸馏水 0.5 0.5 -样品液 - - 0.5混合均匀，在 30℃水浴中预热 5min肾上腺素溶液 - 0.5 0.5加入肾上腺素后，继续保温 2min，然后立即在 480nm 处测定光密度对照管和样品管的光密度值分别为 A 和 B在上述条件下，SOD 抑制肾上腺素自氧化 50%所需的酶量定义为一个酶活力单位即：酶活力（单位）=2（A-B）N/A式中 N——样品稀释倍数；2——抑制肾上腺素自氧化 50%的换算系数6、根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化提取率实验 2、 酿酒酵母细胞固定化一、目的要求了解固定化酶及微生物细胞固定化的原理及其优缺点掌握制备固定化细胞中最基本、最常用的方法。

学会用固定化酿酒酵母进行酒精发酵及酒精的测定方法二、基本原理固定化酶和固定微生物细胞的原理是将酶或微生物细胞利用物理的或化学的方法，使酶或细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性它在固相状态作用于底物，具有离子交换树脂那样的特点，有一定的机械强度，可用搅拌或装柱形式与底物溶液接触由于酶和微生物细胞被固定在载体上，使得它们在反应结束后，可反复使用，也可贮存较长时间使酶和微生物活性不变微生物细胞固定化常用的方法有三大类：1．吸附法；　　2．包埋法；　　3．共价交联法三、实验材料（一）菌种　　酿酒酵母二）培养基1.酒精发酵培养基 YG分装 200 ml 培养基于 300 ml 锥形瓶中，共 4 瓶，经 100 Pa 灭菌备用三）主要药品海藻酸钠、琼脂、K- 角叉胶、葡萄糖、蛋白质、酵母膏、明胶、戌二醛等四、实验内容（一）酵母种子培养液的制备挑取新鲜斜面菌种一环，接入装有 30 ml YPD 培养基的锥形瓶中，30℃振荡培养，共接 4 瓶，培养至对数期二）细胞的固定化：共价交联法吸取 10 ml 培养到对数期的酵母菌悬液加入加 25 ml2％的明胶液中，混合均匀，倒入 15 cm 的无菌平皿中，在 0～5℃ 冻结后，切成 3×3×3mm3 小块，再浸入 1.5％戊二醛中，室温下交联 3 h，将颗粒转入 300 ml 锥形瓶中，用无菌去离子水洗涤三次，加入 YG 培养基，置 30℃培养 72 h 后测定酒精含量。

三）结果观察1．固定化细胞的回收与活菌计数（1）取培养 72 h 的固定化细胞，如含酵母的 K- 角叉凝胶包埋珠 2 粒，放入 5 ml 无菌生理盐水中培养前的凝胶珠同样处理2） 37℃轻振 15 min，使胶珠溶解3）适当稀释后涂布于 YPD 琼脂平板进行活菌计数，观察酵母菌在包埋块中的增殖情况2．酒精发酵液的蒸馏及酒精度的测定（1）由于本次实验发酵液中所含酒精度较低，因此可用明火直接加热蒸馏（图 12-2-2）2）取 100 ml 发酵液，倒入 500 ml 圆底烧瓶中，加 100 ml 蒸馏水蒸馏，沸腾后改用小火当开始流出液体时，用 100 ml 容量瓶准确接收馏出液 100 ml倒入 100 ml 量筒中，用酒精比重计测量其酒精度剩余的发酵液全部倒出后弃去，将固定化细胞用无菌去离子水洗 3 次，加入 YG 培养基继续培养 72 h，测酒精含量，可反复使用数十次　　五、实验报告内容（一）将酿酒酵母细胞固定化经发酵培养后的结果填入下表二）以海藻酸钠凝胶制备为例，阐述微生物细胞包埋法的制作过程三）试比较实验中所用载体对酿酒酵母产酒精量有何差别？六、思考题微生物细胞固定化在发酵工业上有何意义？实验 3、亲和层析法纯化胰蛋白酶一、实验目的1.熟悉亲和层析纯化蛋白质的的原理。

2.初步掌握亲和层析法纯化胰蛋白酶的方法步骤二、实验原理亲和层析主要是根据生物分子与特定的固相化配基之间的亲和力而使生物分子得到分离它是由吸附层析衍生、发展起来的分离技术利用亲和层析载体固相化配基与亲和互补物之间通过范德华力、疏水力、静电力、氢键作用等发生专一性的结合而进行分离亲和层析的载体要选用机械强度高、非特异性吸附少、水不溶性的、具有较多化学反应基团—羟基的多糖类介质，该载体在温和条件下与配基共价偶联，而又不影响配基及被分离物质原有的生物学特性本实验采用猪胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵类粘蛋白作为配基．从猪胰脏的粗提液中分离纯化胰蛋白酶三、仪器、原料和试剂器材：紫外分光光度计、核酸蛋白质检测仪、高速组织捣碎机、恒温水浴摇床、L 层析柱(10mm×100mm)、G —3 玻璃烧结漏斗、酸度计、抽滤瓶原料新鲜猪胰脏试剂1. 环氧氯丙烷， 1，4—二氧六环，乙烯，乙腈，溴化氰2. 5mol/L 硫酸；3. 5.0mol/L 氢氯化钠4. 0.2mol/LpH9.5 碳酸钠缓冲液5. 亲和柱平衡液： 0.5mol/L 氯化钾—0.05mol/L 氯化钙－0.1mol/L，pH7.8 tris-HCl 缓冲液；6. 亲和柱洗脱液： 0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L 氯化钾， pH2.5 混合液；7. pH2.5~3.0 乙酸酸化水。

8. Sepharose 4B ，鸡卵类枯蛋白，纯胰蛋白酶四、操作步骤(一) 载体—SePharose4B 的活化环氧氯丙烷活化法：取适量的 sepharose 4B，于 G—3 玻璃烧结漏斗 (简称 G—3 漏斗)上抽去保护液称 10g(湿重)Sepharose 4B，用 100mL0.5mol/L 氯化钠溶液淋洗，除去 56Pha rose 4S 凝胶内的保护剂，用蒸馏水洗净，转移到 100mL 的锥形瓶内然后加入 6.5mL 2.0moL／L 氢氧比钠溶液、1.5mL 环氧氯丙烷、15mL 56％1，4 二氧六环，于 45℃的恒温水浴摇床内振荡活化 2 小时然后将活化的凝胶转移到 G3 漏斗内抽干，用蒸馏水洗至 pH8.0 左右，再用 20mL 0.1mol/L，pH9.5 碳酸钠缓冲液淋洗处理完毕后立即偶联二) 胰蛋白酶粗操液的制备取 50g 猪新鲜胰脏(除去脂肪和结缔组织)剪碎置于高速组织捣碎机内，加入 200mL 预冷的 pH2.5~3.0 的乙酸酸化水，匀浆于 10℃提取 4 小时以上，4 层纱布过滤，收集滤液并用 5mol/L 的氢氧化钠调至 PH8.0，加入终浓度为0.1mol/L 氯化钙及 1~2mg 胰蛋白酶晶种，置 4℃激活 12~16 小时或在室温(25℃左右)激活 2~4 小时。

待胰蛋白酪比活达到 1000~1500 BAEE 单位／mg 以后，用 6mol/L 硫酸调至 pH3.0 停止激活放置 4℃冰箱内备用测定胰蛋白酶活性三)亲和层析纯化胰蛋白酶取一支层析柱(10mm×100mm)，装入少量亲和柱平衡液(0.5mol/L 氯化钾—0.05mol/L 氯化钙 0.1mol/L，pH7.8 Tris—HCl 缓冲液)，将亲和吸附剂一次装入柱内，待亲和吸附剂自然沉降至约 1/2 总体积后，调节合适的流速用亲和柱平衡液平衡用核酸蛋白质检测仪检测流出液．待基线达到稳定后即可取一定体积的蛋白酶粗提液(30－50mL，视酶液的蛋白浓度及比活而定)调至pH8.0．用滤纸过滤，取滤液上柱吸附，然后用亲和柱平衡液平衡用核酸蛋白质检测仪检测流出液，待基线达到稳定后改用亲和柱洗脱液(0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L 氯化钾，pH2.5 混合液)洗脱收集洗脱峰 2，测定酶蛋白含量及活性，层析图谱，如图 3—9图 3—9 亲和层析纯化胰蛋白酶洗脱曲线平衡液：0.5mol/L 氯化钾，0.05mol/L 氯化钙，0.1mol/L，pH7.8Tris-HCl 缓冲液洗脱液：0.1mol/L 甲酸，0.5mol/L 氯化钾，pH2.5 混合液。

四) 胰蛋白酶的保存经亲和层析分离得到的胰蛋白酶，一般是比较纯的酶，但是酶蛋白的浓度往往很低通常可用 pH5.0 的乙酸透析除去溶液中的无机盐，然后冰冻干燥成粉末，长期保存也可将酶溶液放在－20 ℃的冰箱冰冻保存或者在 4℃，pH3.0的酸性溶液中保存，可保存两年左右五)结果处理。