溃结灵颗粒对大肠湿热型溃疡性结肠炎患者Toll-like受体等指标的影响.doc

1溃结灵颗粒对大肠湿热型溃疡性结肠炎 患者 Toll-like 受体等指标的影响作者：常东 黄志新 樊亚巍 陶永胜 李辉 朱圣鹰 张东坡【摘要】 ：目的 观察中药溃结灵颗粒配合柳氮磺胺吡啶(SASP)对活动期溃疡性结肠炎(UC)的疗效,探讨溃结灵颗粒治疗溃疡性结肠炎的机制方法 活动期 UC(大肠湿热证)患者随机分为治疗组(溃结灵颗粒+SASP)和对照组(SASP),观察中医证候疗效、肠黏膜病变、主要症状积分变化采用常规免疫组化 S-P 法检测治疗前后肠黏膜组织内的 Toll-like 受体 4(TLR4)、CD14、核因子-κB p65(NF-κB p65)的蛋白表达情况结果 治疗组中医证候疗效、肠黏膜疗效高于对照组(P0.05)2 组在改善腹泻、腹痛、腹胀、脓血便、黏液便、里急后重症状方面,治疗后较治疗前均有明显改善(P0.01,P0.05)治疗组在改善腹泻、腹痛、腹胀、里急后重方面较对照组作用明显(P0.01,P0.05)TLR4、CD14、NF-κB p65 的 IA 值在 UC 病理分级间的表达差异有统计学意义(P0.01)2 组治疗后 TLR4、CD14、NF-κB p65 表达较治疗前明显减少(P0.01,P0.05)。

2 组 TLR4、CD14 与 NF-κB p65蛋白表达治疗后差值比较有显著性差异(P0.01,P0.05)结论 溃结灵颗粒配合 SASP 有确切的治疗 UC 的作用,效果显著很可能是通过抑制 TLR4 和 CD14蛋白表达、阻断其受体蛋白,磷酸化激活 κB 的功能减弱,使损伤的内皮细胞得以修复,继而达到治疗 UC 的目的 【关键词】 溃疡性结肠炎 溃结灵颗粒 Toll-like 受体Abstract：Objective To observe the effect and study intervenient action of Kuijieling Granules (KG) in treating ulcerative colitis (UC) during the active period by 2the clinical experiment. Methods The patients of active UC (damp-heat syndrome) were randomly divided into 2 groups (KG+SASP group and SASP group) to observe pathological changes of the mucosa, syndrome effect and main symptoms scores, and the protein expression of TLR4, CD14 and NF-κB p65 were detected by immunohistochemistry. Results KG+SASP group had better effect than SASP group in syndrome and mucosa (P0.05). KG+SASP group had better effect than SASP group on eliminating the syndrome such as diarrhea, abdomenache, burbulence and tenesmus (P0.05). There was no difference in eliminating the syndrome about sanguinopurulent stool and pituitous stool (P0.05). There were outstanding differences among the pathologic grade of UC about IA of TLR4, CD14 and NF-κB p65. The expression of TLR4, CD14 and NF-κB p65 were decreased by treatment (P0.01, P0.05). About the KG+SASP group, there was a obvious decline in the balance of TLR4, CD14 and NF-κB p65 (P0.01, P0.05) compared with SASP group. Conclusion KG has definite effect on UC. It probably controls the protein expression of TLR4 and CD14, and makes endothelial cells restored.Key words：ulcerative colitis；Kuijieling Granules；Toll-like receptor溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种原因不明的炎症性肠病。

探讨其病因及病理学机制,寻求理想的治疗方法,一直是 UC 研究的热点[1]近年研究认为,Toll-like 受体(TLRs)是一个高度保守的先天免疫识别受体家族,可介导炎症反应,启动机体的免疫防御系统[2]溃结灵颗粒(主要成分为救必应、火炭母、地榆、田七等)是广东省名老中医劳绍贤教授治疗大肠湿热型溃疡性结肠炎的经验方本课题以 TLRS 表达为切入点,研究 UC 的发生机制,揭示溃结灵颗粒治疗 UC 的作用靶点和机理现报道如下1 临床资料1.1 一般资料观察对象 60 例均来自近 3 年来武警广东边防总队医院和深圳市中医院的住院和门诊患者其中男性 35 例,女性 25 例,年龄 18～65 岁,病例按来院次序随机分为治疗组和对照组各 30 例其中治疗组男性 19 例,女性 11 例,年龄在 18～63 岁,平3均年龄(34.5±8.6)岁,病程 1～12 年,平均(7.4±4.5)年,病情轻、中、重各 5、20、5 例；对照组男性 18 例,女性 12 例,年龄 20～65 岁,平均(33.2±7.4)岁,病程 1～13 年,平均(8.4±4.2)年,病情轻、中、重各 6、17、7 例2 组性别、平均年龄、平均病程、病情的轻重等方面差异无显著性(P0.05),具有可比性。

1.2 诊断标准活动期 UC 的诊断标准和大肠湿热证 UC 的中医证候标准按中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会修订的 2003 年版《溃疡性结肠炎中西医结合诊治方案(草案)》中的诊断标准和相关的中医证候标准[3]1.3 纳入标准凡符合诊断标准,年龄 18～65 岁,自愿且能够配合试验者纳入观察对象所有受试对象均签署知情同意书1.4 排除标准①年龄小于 18 岁或大于 65 岁；②妊娠或哺乳期的妇女；③感染性肠炎、克隆氏病、结肠息肉等消化道疾病；④有严重的并发症,如局部肠梗阻、肠穿孔、中毒性结肠扩张等；⑤溃疡性结肠炎急性暴发型；⑥并发心脑血管、肝肾疾病、造血系统、肿瘤等严重原发性疾病患者；⑦过敏性体质或对本病过敏者,依从性差者2 治疗与观察方法2.1 治疗方法4治疗组予溃结灵颗粒(由广州中一药业有限公司制备, 5 g/包),5 g/次,3 次/d,温水冲服；同时服用柳氮磺胺吡碇片(SASP,上海信谊嘉华药业有限公司生产,国药准字：H31020557), 1 g/次,4 次/d对照组给予 SASP 片,1 g/次,4 次/d2 组疗程均为 12 个月2.2 观察指标与方法治疗前后行电子肠镜检查,观察肠黏膜病变；观察中医证候疗效、主要症状积分变化情况。

根据 Powell-Tuck 等评分系统定量计算疾病活动度(DAI)分值[4]按照文献[3]进行组织学分级,受检者在肠镜检查中钳取病灶明显处肠黏膜为标本,立即置于多聚甲醛液中固定常规石蜡包埋切片,采用常规免疫组化 S-P 法：组织切片经脱蜡,封闭,抗原热修复；滴加兔抗人多克隆抗体 TLR4(SantaCruzsc sc210741)、CD14(武汉博士德生物试剂公司 BA0719)、核因子-κB p65(NF-κB p65,Santa Cruzsc sc2372),稀释度分别为 1∶50、1∶50、1∶100；滴加二抗,酶标链亲和素复合物；显色；复染；封片每次实验均以 0.01 mol/L PBS 代替一抗作为空白对照采用 Image Pro Plus 图像分析软件进行半定量分析,以细胞质和(或)胞核染为棕黄色为阳性细胞,每个样本随机检测 5 个染色较好的高倍视野(×400),取阳性细胞积分吸光度(IA)的均数,表示该样本 IA 值并根据文献[3]对症状和体征进行分级量化疗效评定标准参照文献[3]主要症状积分变化参考文献[5] 2.3 统计学方法计数资料应用 χ2 检验,等级资料用 Ridit 分析,数据以—x±s 表示。

计量资料的多组间比较用 ONE2WA YANOVA,2 组间比较采用 t 检验；2 组间相关分析采用Spearman 秩相关分析,双侧检验,P0.05 为差异有统计学意义53 结果3.1 2 组患者疗效比较(见表 1～表 3)表 1 2 组患者证候疗效比较(略)注：与对照组相比,△P0.05；*治疗 1 年后半年内复发表 2 2 组患者肠黏膜疗效比较(略)注：与对照组比较,△P0.05 表 3 中医主要症状积分 2 组治疗前后比较(略)注：与本组治疗前比较,△P0.05,△△P0.01；与对照组差值比较,*P0.05,**P0.013.2 TLR4、CD14、NF-κB p65 的 IA 值与 UC 的病理分级(见表 4)表 4 UC 病理分级与 TLR4、CD14、NF-κB p65 IA 值(略)注：与Ⅱ、Ⅲ级比较,*P0.01；与Ⅰ、Ⅲ级比较,△P0.01；与Ⅰ、Ⅱ级比较,☆P0.01结果表明,TLR4、CD14、NF-κB p65 的 IA 值在 UC 病理分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级间的表达差异有统计学意义3.3 2 组治疗前后 TLR4、CD14、NF-κB p65 蛋白表达情况本研究发现,TLR4 分布于肠上皮细胞胞质内靠近核周围基底外侧,分布有一定极性。

CD14、NF-κB p65 的蛋白表达主要定位于细胞核,少部分在细胞浆中也有表达结果表明,治疗组和对照组治疗后 TLR4、CD14、NF-κB p65 表达较治疗前明显减少(P0.01,P0.05)其中治疗组与对照组的 TLR4 蛋白表达治疗后差值比较有显著性差异(P0.01),CD14 与 NF-κB p65 蛋白表达差异亦有显著性意义(P0.05)见表 5表 5 2 组患者治疗前后 TLR4、CD14、NF-κB p65 蛋白表达情6况(略)注：与本组治疗前比较,*P0.05,**P0.01；与治疗组差值比较,▲P0.05,▲▲P0.014 讨论在中医古籍文献中并无“溃疡性结肠炎”这一病名,但根据其临床表现,当隶属于中医学“泄泻”、 “便血”、 “肠风”、 “痢疾”等范畴其病位在大肠,与脾胃关系密切,日久湿热内生,热毒蕴结于肠腑,反复发作其活动期以大肠湿热证型最为常见溃结灵颗粒具有清热利湿、凉血解毒、理气活血、祛瘀止痛之功效本研究结果显示,溃结灵颗粒配合 SASP 的临床症状疗效、肠黏膜疗效及中医症状积分疗效、减少复发率方面均比单纯 SASP 治疗效果显著TLR 是 1997 年发现的天然免疫系统中的细胞跨膜受体,可与病原识别模式分子结合,在 MD2、CD14 辅助下激活下游信号传导分子,最终导致 NF-κB 激活,引发炎症介质表达[6],导致炎症的产生和逐级放大,终致 UC 发生。

有研究表明,LPS 和血清脂多糖结合蛋白复合物,能够通过靶细胞膜上的膜结合型或血清中的可溶性 CD14 分子传导起始信号,在 CD14 分子的作。