微生物的诱变育种.ppt

第七章第七章 工业微生物诱变育种工业微生物诱变育种第一节第一节 诱变育种的试验设计和准备工作诱变育种的试验设计和准备工作第二节第二节 诱变育种的步骤与方法诱变育种的步骤与方法第三节第三节 突变株的分离与筛选突变株的分离与筛选第四节第四节 营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型菌株的筛选第五节第五节 温敏突变株的筛选温敏突变株的筛选第六节第六节 抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育概念：概念：选用理、化致变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，选用理、化致变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促使其突变率显著提高；采用简便、快速和高效的筛选法促使其突变率显著提高；采用简便、快速和高效的筛选法筛选出少数符合育种目的的突变株来供生产实践与研究应筛选出少数符合育种目的的突变株来供生产实践与研究应用目标：目标：提高有效产物的产量提高有效产物的产量改善菌种特性、提高产品质量改善菌种特性、提高产品质量简化工艺条件简化工艺条件开发新品种开发新品种诱变育种的目标及用途诱变育种的目标及用途诱变育种的目标及用途诱变育种的目标及用途青酶素产生菌选育历史青酶素产生菌选育历史第一节第一节 诱变育种的试验设计和准备工诱变育种的试验设计和准备工作作微生物微生物正变株正变株诱变育种诱变育种高产菌株的缺陷：高产菌株的缺陷：(1)(1)孢子数量减少孢子数量减少(2)(2)生活周期延长生活周期延长(3)(3)可能发生回复突变可能发生回复突变负变株负变株发生概率大发生概率大诱变的不可预测性诱变的不可预测性高产突变型菌株是一种数量性状的遗传变异，是由多基因决高产突变型菌株是一种数量性状的遗传变异，是由多基因决定的：定的：1. 1. 这些基因不可能通过一次诱变全部引起突变这些基因不可能通过一次诱变全部引起突变2. 2. 高产菌株产量的提高，是多代诱发突变积累的结果。

只有那高产菌株产量的提高，是多代诱发突变积累的结果只有那些每次诱变后有些每次诱变后有1 1～～2 2个控制产量的基因突变，使产物合成稍有个控制产量的基因突变，使产物合成稍有增加，又能维持其最起码代谢平衡的菌株才能生存下来增加，又能维持其最起码代谢平衡的菌株才能生存下来3. 3. 高产菌株的环境适应能力差，育种时必须注意调整环境条件高产菌株的环境适应能力差，育种时必须注意调整环境条件诱变育种的复杂性诱变育种的复杂性1. 1. 在诱变育种前，应该对大生产的设备和工艺具有相当的知在诱变育种前，应该对大生产的设备和工艺具有相当的知识和全面的了解识和全面的了解2. 2. 诱变育种工作量大，周期长，对一般周期为诱变育种工作量大，周期长，对一般周期为7 7～～1010天的抗生天的抗生素菌种来说，一代诱变需素菌种来说，一代诱变需2 2～～3 3月，因此事先需作好充分准备，月，因此事先需作好充分准备，如全面了解菌种培养特征和生化特征，以及有关培养条件对如全面了解菌种培养特征和生化特征，以及有关培养条件对其影响等，最后再进行严密设计，确定正确的选育程序和方其影响等，最后再进行严密设计，确定正确的选育程序和方法。

法诱变育种的注意事项诱变育种的注意事项诱变育种工作的三个主要环节：诱变育种工作的三个主要环节：1. 1. 诱发突变诱发突变出发菌株、诱变剂及其剂量的选择、影响诱变效果的因素等出发菌株、诱变剂及其剂量的选择、影响诱变效果的因素等2. 2. 突变株的筛选突变株的筛选筛选条件筛选条件( (培养基和培养条件培养基和培养条件) )、便捷的筛选方法等、便捷的筛选方法等3. 3. 最佳环境条件的调整最佳环境条件的调整突变株最佳培养条件的确定突变株最佳培养条件的确定诱变育种的主要环节诱变育种的主要环节1. 1. 区分不同菌落类型区分不同菌落类型 1.11.1 诱变前对出发菌株的了解诱变前对出发菌株的了解2. 2. 出现不同菌落类型的原因出现不同菌落类型的原因主要原因：遗传因素主要原因：遗传因素由遗传因素造成的不同类型菌落是一种变异现象，属不同由遗传因素造成的不同类型菌落是一种变异现象，属不同遗传特性的个体，而且可以遗传给下一代遗传特性的个体，而且可以遗传给下一代其它原因：非遗传因素，如培养基组成或培养条件的改变其它原因：非遗传因素，如培养基组成或培养条件的改变等等非遗传因素产生的非遗传因素产生的““变异变异””是一种假变异，不能遗传；菌是一种假变异，不能遗传；菌种重新移回原来的培养基和培养条件，形态可恢复原状。

种重新移回原来的培养基和培养条件，形态可恢复原状为了研究遗传因素引起的不同菌落类型，应尽量避为了研究遗传因素引起的不同菌落类型，应尽量避免非遗传因素引起的菌落形态变化，以免鱼目混珠、免非遗传因素引起的菌落形态变化，以免鱼目混珠、干扰试验结果干扰试验结果1.11.1 诱变前对出发菌株的了解诱变前对出发菌株的了解1. 1. 多方面考查菌种的生活史，了解它们的形态、生理、生多方面考查菌种的生活史，了解它们的形态、生理、生化等生物学特性，以及这些特性与代谢产物合成的关系化等生物学特性，以及这些特性与代谢产物合成的关系 土霉素产生菌斜面孢子培养土霉素产生菌斜面孢子培养3~43~4天好于天好于9~109~10天天2. 2. 研究菌种的某些生物学特性与产量合成的相关性研究菌种的某些生物学特性与产量合成的相关性 头孢霉素产量与孢子大小和数量成正比头孢霉素产量与孢子大小和数量成正比. .1.21.2 菌种特性与生产性能关系菌种特性与生产性能关系1. 1. 培养基培养基2. 2. 培养基斜面制备技术培养基斜面制备技术3. 3. 移种的密度移种的密度4. 4. 温度温度5. 5. 湿度湿度6. 6. 药品和原材料质量药品和原材料质量1.3 1.3 影响菌种生长发育的主要因素影响菌种生长发育的主要因素了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合成过程中了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合成过程中与培养条件的关系与培养条件的关系建立一个准确、简便、快速检测产物的方法建立一个准确、简便、快速检测产物的方法研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件1.4 1.4 对其它条件的了解对其它条件的了解第二节第二节 诱变育种的步骤与方法诱变育种的步骤与方法诱变育种的原则诱变育种的原则 挑选优良易诱的出发菌株挑选优良易诱的出发菌株处理均匀的单胞或孢悬液处理均匀的单胞或孢悬液选择简便有效的诱变剂选择简便有效的诱变剂选用最适剂量及作用时间选用最适剂量及作用时间充分利用致变剂的协同效应充分利用致变剂的协同效应寻求可见的选择性相关指标寻求可见的选择性相关指标设计高效筛选方案与方法设计高效筛选方案与方法 诱变育种具有方法简单、投资少、收获大等优点，诱变育种具有方法简单、投资少、收获大等优点，最大缺点是缺乏定向性。

因此，除了深入开展诱变机最大缺点是缺乏定向性因此，除了深入开展诱变机制研究外，在诱变育种过程中应注意制研究外，在诱变育种过程中应注意: :野生菌株野生菌株: :产量低，但对诱变因素敏感，变异幅产量低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高；度大，正突变率高；最好是由生产育种中的自发变异株最好是由生产育种中的自发变异株采用具有有利性状的菌株采用具有有利性状的菌株考虑选择己发生过其他变异的菌株考虑选择己发生过其他变异的菌株选择增变菌株的变异株以堤高致变敏度选择增变菌株的变异株以堤高致变敏度选取能累积少量所需产物或前体物菌株选取能累积少量所需产物或前体物菌株2.1 2.1 出发菌株出发菌株1. 1. 对一般出发菌株的要求对一般出发菌株的要求1. 1. 选择具备一定生产能力或某种特性的菌株作为出选择具备一定生产能力或某种特性的菌株作为出发菌株发菌株2. 2. 选择纯种作出发菌株选择纯种作出发菌株3. 3. 选择出发菌株应考虑其稳定性选择出发菌株应考虑其稳定性4. 4. 连续诱变育种过程中如何选择出发菌株连续诱变育种过程中如何选择出发菌株2.1 2.1 出发菌株出发菌株2. 2. 对出发菌株的具体要求对出发菌株的具体要求2.1 2.1 出发菌株出发菌株–4. 4. 连续诱变育种过程中如何选择出发菌株连续诱变育种过程中如何选择出发菌株2. 2. 对出发菌株的具体要求对出发菌株的具体要求5. 5. 选择出发菌株的其它因素选择出发菌株的其它因素6. 6. 采用多出发菌株采用多出发菌株(3-4(3-4个个) )7. 7. 菌种代谢特点菌种代谢特点2.1 2.1 出发菌株出发菌株2. 2. 对出发菌株的具体要求对出发菌株的具体要求一般丝状菌的野生菌株多数为异核体，如果菌种背一般丝状菌的野生菌株多数为异核体，如果菌种背景复杂，用诱变剂处理后的变株中，负变率将增加。

景复杂，用诱变剂处理后的变株中，负变率将增加因此，微生物菌种选育之前的出发菌株和新变种获因此，微生物菌种选育之前的出发菌株和新变种获得之后，都要进行自然分离，即菌种纯化得之后，都要进行自然分离，即菌种纯化常用的纯化方法有划线分离法和稀释分离法；若仍常用的纯化方法有划线分离法和稀释分离法；若仍达不到要求，则需采用显微镜操纵器分离单孢子，达不到要求，则需采用显微镜操纵器分离单孢子，培养形成单菌落，得到纯菌株培养形成单菌落，得到纯菌株2.2 2.2 出发菌株的纯化出发菌株的纯化1. 1. 供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮细胞生理活性方面既要同步，又要处于最旺盛的对数期细胞生理活性方面既要同步，又要处于最旺盛的对数期对于细菌来说，常常通过前培养达到要求对于细菌来说，常常通过前培养达到要求对于丝状菌来说，制备菌悬液时力求对于丝状菌来说，制备菌悬液时力求9090％以上为单孢子，并务必％以上为单孢子，并务必除去菌丝片段，因为一般菌丝是多核的除去菌丝片段，因为一般菌丝是多核的菌悬液的孢子或细菌数可用平板计数、血球计数器计数和光密度菌悬液的孢子或细菌数可用平板计数、血球计数器计数和光密度法测定。

法测定制备菌悬液通常采用生理盐水，如果用化学诱变剂处理时，则应制备菌悬液通常采用生理盐水，如果用化学诱变剂处理时，则应采用相应的缓冲液配制采用相应的缓冲液配制2.3 2.3 单孢子单孢子( (或单细胞或单细胞) )悬液的制备悬液的制备2. 2. 菌悬液制备方法菌悬液制备方法(1) (1) 细菌细菌采用同步化的预培养方法：采用同步化的预培养方法：2020～～24h 24h 培养培养的新鲜斜面的新鲜斜面基本培养基基本培养基 3535～～37℃37℃振振荡培养至对数期荡培养至对数期6℃6℃培养培养1h 1h ，，使之同步生长使之同步生长加入适量嘧啶、嘌呤加入适量嘧啶、嘌呤或酵母膏，继续振荡或酵母膏，继续振荡培养培养2020～～60 min60 min低温低温(2℃)10min(2℃)10min离心洗涤离心洗涤制备菌悬液制备菌悬液含玻璃珠三角瓶含玻璃珠三角瓶振荡振荡10min10min菌体计数，菌体计数，调整浓度调整浓度过滤过滤2.3 2.3 单孢子单孢子( (或单细胞或单细胞) )悬液的制备悬液的制备(2) (2) 产孢子菌类产孢子菌类 处理材料是孢子，而不是菌丝。

处理材料是孢子，而不是菌丝(3) (3) 不产孢子的真菌不产孢子的真菌直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理三种方法：三种方法：菌丝尖端法菌丝尖端法处理单菌落周围尖端菌丝处理单菌落周围尖端菌丝混合处理法混合处理法成熟而新成熟而新鲜的孢子鲜的孢子液体培养基液体培养基 振荡培振荡培养至孢子刚刚萌发养至孢子刚刚萌发振荡打碎孢子振荡打碎孢子团块团块离心洗涤离心洗涤菌体计数，菌体计数，调整浓度调整浓度过滤过滤加入缓冲液加入缓冲液2.3 2.3 单孢子单孢子( (或单细胞或单细胞) )悬液的制备悬液的制备2. 2. 菌悬液制备方法菌悬液制备方法1. 1. 诱变剂种类的选择诱变剂种类的选择(1) (1) 选择诱变剂选择诱变剂 (2) (2) 根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂 遗传稳定的遗传稳定的: :先强后弱先强后弱; ; 遗传不稳定的遗传不稳定的: :先选优良出发菌株先选优良出发菌株, ,后温和诱变后温和诱变(3) (3) 参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂通常做法：取几种诱变剂，各取不同剂量做一系列诱通常做法：取几种诱变剂，各取不同剂量做一系列诱变试验，挑选处理后的菌落上千个，进行生产能力的变试验，挑选处理后的菌落上千个，进行生产能力的测定，作出生产能力分布状况，然后分别统计它们的测定，作出生产能力分布状况，然后分别统计它们的正突变株、负突变株和稳定株的频率。

正突变株、负突变株和稳定株的频率2.4 2.4 诱变剂及诱变剂量诱变剂及诱变剂量2. 2. 最适诱变剂量的选择最适诱变剂量的选择(2) (2) 最大形态变异率的最大形态变异率的剂量不一定是诱发正变剂量不一定是诱发正变的最适剂量的最适剂量1) (1) 使所希望得到的突变使所希望得到的突变株在存活群体中占有最株在存活群体中占有最大的比例大的比例2.4 2.4 诱变剂及诱变剂量诱变剂及诱变剂量(3) (3) 诱变剂对产量的诱变作用，大致趋向是：处理剂量大，杀菌诱变剂对产量的诱变作用，大致趋向是：处理剂量大，杀菌率高率高(90(90～～9999％％) )，在单位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少；，在单位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少；但在不多的正变株中可能筛选到产量提高幅度大的变株但在不多的正变株中可能筛选到产量提高幅度大的变株2. 2. 最适诱变剂量的选择最适诱变剂量的选择2.4 2.4 诱变剂及诱变剂量诱变剂及诱变剂量3. 3. 诱变剂种类和剂量选择的一般原则诱变剂种类和剂量选择的一般原则(1) (1) 经长期诱变后的高产菌株，采用低剂量处理；经长期诱变后的高产菌株，采用低剂量处理；(2) (2) 遗传性状不太稳定的菌株，宜采用较温和的诱变剂和较低的剂量遗传性状不太稳定的菌株，宜采用较温和的诱变剂和较低的剂量处理；处理；(3) (3) 要求筛选具有特殊性状的菌株，或较大幅度提高产量的菌株，可要求筛选具有特殊性状的菌株，或较大幅度提高产量的菌株，可用强诱变剂和高剂量处理；用强诱变剂和高剂量处理；(4) (4) 诱变史短的野生低产菌株，开始时采用较高剂量，然后逐步使用诱变史短的野生低产菌株，开始时采用较高剂量，然后逐步使用较温和的诱变剂或低剂量处理；较温和的诱变剂或低剂量处理；(5) (5) 多核细胞菌株，采用较高剂量更合适。

多核细胞菌株，采用较高剂量更合适2.4 2.4 诱变剂及诱变剂量诱变剂及诱变剂量1. 1. 单因子处理单因子处理2.5 2.5 诱变剂的处理方式诱变剂的处理方式(1) (1) 两个以上因子同时处理两个以上因子同时处理2. 2. 复合因子处理复合因子处理2.5 2.5 诱变剂的处理方式诱变剂的处理方式2. 2. 复合因子处理复合因子处理2.5 2.5 诱变剂的处理方式诱变剂的处理方式•(2) (2) 不同诱变剂交替处理不同诱变剂交替处理•(3) (3) 同一种诱变剂连续重复使用同一种诱变剂连续重复使用•(4) (4) 紫外线光复活交替处理紫外线光复活交替处理•(5) (5) 诱变剂处理时间与诱变效应的关系诱变剂处理时间与诱变效应的关系1. 1. 菌种遗传特性与生理状况菌种遗传特性与生理状况2. 2. 菌体细胞壁结构菌体细胞壁结构3. 3. 环境条件的影响环境条件的影响(1) (1) 诱变前预培养和诱变后培养诱变前预培养和诱变后培养(2) (2) 温度、温度、pHpH、氧气等外界条件对、氧气等外界条件对诱变效应的影响诱变效应的影响(3) (3) 平皿密度效应平皿密度效应2.6 2.6 影响突变率的因素影响突变率的因素第三节第三节 突变株的分离与筛选突变株的分离与筛选筛选的发展趋势：筛选的发展趋势： 随机乱向筛选随机乱向筛选 定向筛选定向筛选突变是随机不定向的，但是筛选是定向的，培养基和突变是随机不定向的，但是筛选是定向的，培养基和培养条件是决定菌种某些特性保留或淘汰的培养条件是决定菌种某些特性保留或淘汰的““筛子筛子””。

筛选根据主次分为初筛和复筛筛选根据主次分为初筛和复筛初筛：以多为主，尽量扩大筛选范围初筛：以多为主，尽量扩大筛选范围复筛：以质和精为主，反复多次，结合自然分离，选育高复筛：以质和精为主，反复多次，结合自然分离，选育高产或其他优良菌株产或其他优良菌株3.1 3.1 诱变育种的基本环节诱变育种的基本环节1. 1. 常规筛选程序常规筛选程序3.2 3.2 诱变育种的基本环节诱变育种的基本环节2. 2. 简便筛选程序简便筛选程序3.2 3.2 诱变育种的基本环节诱变育种的基本环节1. 1. 随机筛选随机筛选即摇瓶筛选即摇瓶筛选优点：不管种子或发酵过程的生产条件、生理条件如何，都与发酵罐优点：不管种子或发酵过程的生产条件、生理条件如何，都与发酵罐大生产条件相近，可以模拟进行大生产条件相近，可以模拟进行缺点：在突变率小的情况下，如果菌落挑取少，很难筛选到理想的突缺点：在突变率小的情况下，如果菌落挑取少，很难筛选到理想的突变株2. 2. 平板菌落预筛平板菌落预筛根据特定代谢产物的特异性，利用琼脂平板进行筛选和活性粗测的根据特定代谢产物的特异性，利用琼脂平板进行筛选和活性粗测的方法，大幅度扩大有效筛选量，提高筛选工作效率。

方法，大幅度扩大有效筛选量，提高筛选工作效率几种具体方法几种具体方法3.3 3.3 分离和筛选分离和筛选A. A. 根据形态筛选变株根据形态筛选变株B. B. 根据平板菌落生化反应筛选变株根据平板菌落生化反应筛选变株C. C. 采用冷敏感菌筛选抗生素变株采用冷敏感菌筛选抗生素变株: :先低温后高温培养先低温后高温培养. .3.3 3.3 分离和筛选分离和筛选2. 2. 平板菌落预筛平板菌落预筛D D 浓度梯度法浓度梯度法E E 应用复印技术快速筛应用复印技术快速筛选变株选变株3.3 3.3 分离和筛选分离和筛选2. 2. 平板菌落预筛平板菌落预筛 F. F.琼脂块大通量筛选变株琼脂块大通量筛选变株优点优点1 1：判断活性圈准确：判断活性圈准确所有菌落限制在同面积琼脂块所有菌落限制在同面积琼脂块上，避免相互干扰；上，避免相互干扰；每个菌落的产物都在相同体积每个菌落的产物都在相同体积的琼脂块中，避免扩散造成的的琼脂块中，避免扩散造成的误差优点优点2 2：大幅度增加筛选量：大幅度增加筛选量不足：培养条件与发酵条件不足：培养条件与发酵条件有较大距离，易漏筛有较大距离，易漏筛解决办法：制备琼脂块用发酵解决办法：制备琼脂块用发酵培养基培养基3.3 3.3 分离和筛选分离和筛选2. 2. 平板菌落预筛平板菌落预筛摇瓶培养通常分为初筛和复筛。

摇瓶培养通常分为初筛和复筛初筛时菌株较多，常用锥形瓶或大号试管摇床培养；初筛时菌株较多，常用锥形瓶或大号试管摇床培养；复筛时一个菌株重复复筛时一个菌株重复3 3～～5 5个试验瓶，以提高重演性；必要时还可个试验瓶，以提高重演性；必要时还可采用两种以上的培养基进行筛选，以防漏筛采用两种以上的培养基进行筛选，以防漏筛摇瓶筛选实际上是各变异株之间的对比试验，有关摇瓶的摇瓶筛选实际上是各变异株之间的对比试验，有关摇瓶的各种条件要力求一致各种条件要力求一致3.4 3.4 摇瓶液体培养摇瓶液体培养1. 1. 琼脂平板活性圈法琼脂平板活性圈法2. 2. 纸片法纸片法: :发酵液浓度高时发酵液浓度高时3. 3. 琼脂薄层纸片法琼脂薄层纸片法4. 4. 自动生化仪器分析法自动生化仪器分析法3.5 3.5 产物活性测定产物活性测定透明圈透明圈变色圈变色圈生长圈生长圈抑菌圈抑菌圈( (水解酶、有机酸）水解酶、有机酸） （产酸菌）（产酸菌）（工具菌（工具菌+ +待检菌）待检菌） （抗生素）（抗生素）菌株产量的检测的两种误差：菌株产量的检测的两种误差： A A）摇瓶培养条件变化影响遗传特性的表达；）摇瓶培养条件变化影响遗传特性的表达； B B）检测过程中的误差。

检测过程中的误差 所以，对摇瓶发酵液的测试数据要尽量应用生物学所以，对摇瓶发酵液的测试数据要尽量应用生物学统计方法来处理，以便从复杂的差异中，去伪存真，找统计方法来处理，以便从复杂的差异中，去伪存真，找出其中的规律性出其中的规律性在试验过程中的每个阶段，都要周密地观察并记录菌株在试验过程中的每个阶段，都要周密地观察并记录菌株特性然后综合菌落的形态特征、培养特征及生化特征特性然后综合菌落的形态特征、培养特征及生化特征作为初筛时挑选菌落的依据作为初筛时挑选菌落的依据要对筛选过程中摇瓶产量数据的分布作全面分析，以便要对筛选过程中摇瓶产量数据的分布作全面分析，以便帮助判断诱变剂、诱变剂量及筛选条件的选择是否恰当帮助判断诱变剂、诱变剂量及筛选条件的选择是否恰当3.6 3.6 数据调整与菌株特性分析数据调整与菌株特性分析表型表型= =基因型＋环境基因型＋环境 改变环境条件（调整培养配方和培养条件），使变株得到充分改变环境条件（调整培养配方和培养条件），使变株得到充分表达的机会，使高产性状及其他优良特性完全发挥出来，表达的机会，使高产性状及其他优良特性完全发挥出来，3.7 3.7 培养基和培养条件的调整培养基和培养条件的调整1 1 正交的含义正交的含义数学上：是把各个因素数学上：是把各个因素( (如培养基中各种组成成分如培养基中各种组成成分) )的不同水的不同水平平( (各组成成分的不同含量各组成成分的不同含量) )相互只遇一次的搭配，相互只遇一次的搭配，正交设计：在任意两因素间保持因素水平的严密正交性。

正交设计：在任意两因素间保持因素水平的严密正交性优点：优点：A A）使参与试验的各因素的不同水平之间保持严密的正交；）使参与试验的各因素的不同水平之间保持严密的正交；B B）使试验全部因素的不同水平均衡地分布在有限处理中，用）使试验全部因素的不同水平均衡地分布在有限处理中，用少数几个处理就能获得比较丰富的试验信息，得出较全面的少数几个处理就能获得比较丰富的试验信息，得出较全面的结论；结论；C C）能给试验因素间的交互作用及试验误差以恰当的估计能给试验因素间的交互作用及试验误差以恰当的估计3.7 3.7 培养基和培养条件的调整培养基和培养条件的调整 2 2 正交试验设计的方法步骤正交试验设计的方法步骤1. 1. 确定试验的培养基组成成分确定试验的培养基组成成分( (因素因素) )和每种组成成分和每种组成成分所取的含量所取的含量( (水平水平) )3.7 3.7 培养基和培养条件的调整培养基和培养条件的调整2. 2. 选用正交表选用正交表3. 3. 表头设计表头设计4. 4. 列出试验方案列出试验方案5. 5. 实施实验方案实施实验方案3.7 3.7 培养基和培养条件的调整培养基和培养条件的调整2 2 正交试验设计的方法步骤正交试验设计的方法步骤灰黄霉素产生菌灰黄霉素产生菌D-756D-756发酵特性研究试验方案。

发酵特性研究试验方案3.7 3.7 培养基和培养条件的调整培养基和培养条件的调整2 2 正交试验设计的方法步骤正交试验设计的方法步骤 3. 3.正交试验结果正交试验结果 A. A. 极差分析极差分析(1) (1) 统计试验结果统计试验结果(2) (2) 计算计算K K、、R R值值(3) (3) 因素与试验结果的因素与试验结果的关系图关系图 NaNa》》大米粉大米粉》》KClKCl(4) (4) 比较各因素的作用比较各因素的作用3.7 3.7 培养基和培养条件的调整培养基和培养条件的调整B. B. 方差分析方差分析 为了判断实验因素之间的差异是来自于随机误差还是为了判断实验因素之间的差异是来自于随机误差还是来自于其本质的差异，可以通过计算方差，得出来自于其本质的差异，可以通过计算方差，得出F F比值查查F F分布表得临界值分布表得临界值F F 0.05 0.05 (2, 11)=3.98, F(2, 11)=3.98, FA A、、F FB B、、F FC C的值均大于的值均大于3.983.98，说明因素，说明因素A A、、B B、、C C的各水平对灰黄霉素发酵特性的影响均有极显著的差异。

的各水平对灰黄霉素发酵特性的影响均有极显著的差异3.7 3.7 培养基和培养条件的调整培养基和培养条件的调整 3. 3.正交试验结果正交试验结果1. 1. 以同工酶以同工酶 (Isoenzyme) (Isoenzyme) 作为一种生化指标，研究各种突变株，以作为一种生化指标，研究各种突变株，以便从分子水平分析研究一些突变体的实用价值和理论意义便从分子水平分析研究一些突变体的实用价值和理论意义同工酶：同一种属中，由不同基因位点或等位基因编同工酶：同一种属中，由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂聚体，其分子的一级结码的多肽链单体、纯聚体或杂聚体，其分子的一级结构及理化性质和生理功能不同，而催化功能相同的多构及理化性质和生理功能不同，而催化功能相同的多种形式的酶类种形式的酶类2. 2. 菌株红外吸收特性一定程度上可以反映菌株红外吸收特性一定程度上可以反映DNADNA的吸收特性的吸收特性3. 3. 菌株遗传物质特性，如染色体结构、基因图谱等，也值得分析菌株遗传物质特性，如染色体结构、基因图谱等，也值得分析3.8 3.8 变种的特性研究与鉴定变种的特性研究与鉴定1. 1. 碱性脂肪酶高产变株碱性脂肪酶高产变株FS1884FS1884的选育的选育(1) (1) 原生质体作为诱变材料原生质体作为诱变材料(2) (2) 采用定向控制的理性筛选采用定向控制的理性筛选————抗阻遏和解除反馈抑制筛选模型抗阻遏和解除反馈抑制筛选模型------添加添加琥珀酸钠（脂肪酶底物的类似物）和制霉菌素（引起膜透性改变，筛琥珀酸钠（脂肪酶底物的类似物）和制霉菌素（引起膜透性改变，筛选高渗菌）到分离平板。

选高渗菌）到分离平板3) (3) 初筛采用大通量的琼脂块法（初筛菌株越多，漏筛率越低）初筛采用大通量的琼脂块法（初筛菌株越多，漏筛率越低）(4) (4) 结合饰变育种结合饰变育种饰变育种是对具有高产基因型变株进行外界环境条件饰变育种是对具有高产基因型变株进行外界环境条件————培养基和培养条件培养基和培养条件的调整3.8 3.8 诱变育种实例诱变育种实例2. 2. 灰黄霉素耐前体变株灰黄霉素耐前体变株D-756D-756的育种的育种(1) (1) 为达到不用乳糖和玉米浆为原料的定向筛选要求，共设计了为达到不用乳糖和玉米浆为原料的定向筛选要求，共设计了108108种不同组分的培养基配方，控制发酵周期在种不同组分的培养基配方，控制发酵周期在200h200h左右最终左右最终选出大米粉为碳氮源的种子和发酵培养基选出大米粉为碳氮源的种子和发酵培养基3.8 3.8 诱变育种实例诱变育种实例 (2) 27 (2) 27种单一和复合诱变剂比较，紫外线＋氯化锂复合处理的效果最好种单一和复合诱变剂比较，紫外线＋氯化锂复合处理的效果最好 (3) 4541(3) 4541野生菌对紫外线＋氯化锂具有高度敏感性，连续处理野生菌对紫外线＋氯化锂具有高度敏感性，连续处理1313代后形态特征代后形态特征发生明显变化，获得了白色孢子变株，单位产量也不断递增。

发生明显变化，获得了白色孢子变株，单位产量也不断递增 (4) (4) 挑菌标准，挑选营养菌丝色素为浅色者，色素越浅产量越高挑菌标准，挑选营养菌丝色素为浅色者，色素越浅产量越高 (5) (5) 通过通过20002000多株菌的定向筛选，最后选出了不用乳糖和玉米浆为原料，发多株菌的定向筛选，最后选出了不用乳糖和玉米浆为原料，发酵周期为酵周期为207h207h，发酵单位在，发酵单位在37000U/ml37000U/ml以上的高产变株以上的高产变株3.8 3.8 诱变育种实例诱变育种实例2. 2. 灰黄霉素耐前体变株灰黄霉素耐前体变株D-756D-756的育种的育种第四节第四节 营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型营养缺陷型(auxotroph)(auxotroph)：野生型菌株经过人工诱变或自然突：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长原养型原养型(prototroph)(prototroph)：营养缺陷型菌株经回复突变或重组变：营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。

异后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同筛选营养缺陷株时，与之有关的培养基有三类：筛选营养缺陷株时，与之有关的培养基有三类：1. 1. 基本培养基基本培养基(minimal medium, MM)(minimal medium, MM)2. 2. 完全培养基完全培养基(plete medium, CM)(plete medium, CM)3. 3. 补充培养基补充培养基(supplemental medium, SM)(supplemental medium, SM)1. 1.诱发营养缺陷型诱发营养缺陷型: : 亚硝基，亚硝酸，紫外线亚硝基，亚硝酸，紫外线2. 2.淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株(1) (1) 抗生素法抗生素法( (以青霉素为例以青霉素为例) )(2) (2) 菌丝过滤法菌丝过滤法(3) (3) 高温杀菌法高温杀菌法诱变处理后的菌体采用诱变处理后的菌体采用CMCM培养培养2 2～～3 3代代菌体离心菌体离心 、洗涤，转移至、洗涤，转移至MMMM中进行饥饿培养中进行饥饿培养4 4～～6h6h再转移至含无机氮的培养基中再转移至含无机氮的培养基中3 3～～4h4h，使野生型细胞刚刚进入对数，使野生型细胞刚刚进入对数期，加入青霉素培养数小时，分期，加入青霉素培养数小时，分别涂布别涂布CMCM和和MMMM平板平板统计统计CMCM和和MMMM平板上菌落的平板上菌落的差数，确定哪种青霉素浓度差数，确定哪种青霉素浓度的样品中含缺陷型数量最大，的样品中含缺陷型数量最大，进一步分离营养缺陷型进一步分离营养缺陷型4.1 4.1 营养缺陷型菌株的分离和筛选营养缺陷型菌株的分离和筛选3. 3. 营养缺陷型的检出营养缺陷型的检出(1) (1) 点植对照法点植对照法•(2) (2) 影印法影印法 注意事项：注意事项：–①①加入加入0.50.5％脱氧胆酸钠或在％脱氧胆酸钠或在MMMM中用山梨糖作为碳源，再加中用山梨糖作为碳源，再加入适量蔗糖可使菌落小而紧密；入适量蔗糖可使菌落小而紧密；–②②改进操作，克服孢子扩散而改进操作，克服孢子扩散而带来的不纯现象。

带来的不纯现象4.1 4.1 营养缺陷型菌株的分离和筛选营养缺陷型菌株的分离和筛选(4) (4) 限量补充培养法限量补充培养法限量培养：含限量培养：含0.010.01％蛋白％蛋白胨的基本培养基，用于胨的基本培养基，用于检出营养缺陷型菌株检出营养缺陷型菌株补充培养：采用含某种补充培养：采用含某种单一氨基酸、维生素或单一氨基酸、维生素或碱基的基本培养基，用碱基的基本培养基，用于定向筛选某种特定的于定向筛选某种特定的缺陷型菌株缺陷型菌株3) (3) 夹层法夹层法4.1 4.1 营养缺陷型菌株的分离和筛选营养缺陷型菌株的分离和筛选3. 3. 营养缺陷型的分离检出营养缺陷型的分离检出主要筛选主要筛选方法归纳方法归纳示意图示意图4.1 4.1 营养缺陷型菌株的分离和筛选营养缺陷型菌株的分离和筛选4. 4. 营养缺陷型的鉴定营养缺陷型的鉴定(1) (1) 鉴定方法鉴定方法① ① 一个平皿中加入一种营养物质以测定生长因子需求情况一个平皿中加入一种营养物质以测定生长因子需求情况②②生长谱法：在同一平皿上测定许多种生长因子的需求情况生长谱法：在同一平皿上测定许多种生长因子的需求情况(2) (2) 营养缺陷型鉴定步骤营养缺陷型鉴定步骤① ① 缺陷型类别的测定缺陷型类别的测定a: a: 氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸b: b: 酵母浸出液，其中氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶均有酵母浸出液，其中氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶均有c: c: 维生素混合物，代表维生素类维生素混合物，代表维生素类d: d: 核酸碱基混合液或酵母核酸，代表嘌呤、嘧啶类核酸碱基混合液或酵母核酸，代表嘌呤、嘧啶类4.1 4.1 营养缺陷型菌株的分离和筛选营养缺陷型菌株的分离和筛选② ② 缺陷型所需生长因子的测定缺陷型所需生长因子的测定4.1 4.1 营养缺陷型菌株的分离和筛选营养缺陷型菌株的分离和筛选•(2) (2) 营养缺陷型鉴定步骤营养缺陷型鉴定步骤–4. 4. 营养缺陷型的鉴定营养缺陷型的鉴定A A－－1010B B－－7 7C C－－1414 1. 1. 生产实践中的应用生产实践中的应用(1) (1) 用于工业微生物育种，协助解除代谢反馈调控机制，达到大用于工业微生物育种，协助解除代谢反馈调控机制，达到大量积累终产物的目的。

量积累终产物的目的(2) (2) 作为生产菌种杂交、重组育种时的遗传标作为生产菌种杂交、重组育种时的遗传标2. 2. 基础理论研究中的应用基础理论研究中的应用(1) (1) 阐明微生物代谢途径阐明微生物代谢途径(2) (2) 在遗传规律中的转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子在遗传规律中的转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子等研究中，营养缺陷型是最常用的标记菌种等研究中，营养缺陷型是最常用的标记菌种4.24.2 营养缺陷型突变株的应用营养缺陷型突变株的应用第五节第五节 温敏突变株的筛选温敏突变株的筛选1. 1. 概念：温敏突变株概念：温敏突变株(temperature-sensitive mutant, TS(temperature-sensitive mutant, TS突变株突变株) )是一类条是一类条件致死突变株：件致死突变株：在许可的温度下能正常生长，表型和野生型没有区别；在许可的温度下能正常生长，表型和野生型没有区别；在非许可的温度下不能正常生长，表型和野生型不同在非许可的温度下不能正常生长，表型和野生型不同2. TS2. TS突变株的形成原因：突变株的形成原因：主要由必需基因突变所导致的基因产物主要由必需基因突变所导致的基因产物( (如酶如酶) )的结构发生改变而引起的，即的结构发生改变而引起的，即酶蛋白一级结构发生改变，而酶的活性中心并未发生变化。

酶蛋白一级结构发生改变，而酶的活性中心并未发生变化有时非必需基因突变也可产生温敏突变株，但这类突变株在非许可温度下生有时非必需基因突变也可产生温敏突变株，但这类突变株在非许可温度下生长时，需要补充其他条件，如生长因子等长时，需要补充其他条件，如生长因子等3. TS3. TS突变株由许可温度转入非许可温度培养时，并不会立即停止生突变株由许可温度转入非许可温度培养时，并不会立即停止生长繁殖，这是工业发酵所利用的重要生理生化特性长繁殖，这是工业发酵所利用的重要生理生化特性5.1 5.1 温敏突变株的特性温敏突变株的特性 1. 1.温敏突变株的诱发温敏突变株的诱发由于此类突变株主要由基因错义突变所致，所以使用诱变剂由于此类突变株主要由基因错义突变所致，所以使用诱变剂时，要选择易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，时，要选择易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚硝酸、紫外线等诱变剂或亚硝酸、紫外线等诱变剂2. 2. 富集富集1. 1. 抗生素法抗生素法2. 2. 过滤或离心法过滤或离心法3. H33. H3－前体法－前体法5.2 5.2 温敏突变株的筛选方法温敏突变株的筛选方法 3. 3. 分离筛选分离筛选1. 1. 常规法常规法非必需基因突变温敏株：非许可温度，非必需基因突变温敏株：非许可温度，MMMM中不中不长，长，CMCM中生长。

中生长必需基因突变的温敏株：非许可温度下，必需基因突变的温敏株：非许可温度下，MMMM和和CMCM中均不生长中均不生长2. 2. 特殊分离筛选方法特殊分离筛选方法例：由甲醇和甘氨酸合成高产丝氨酸菌株的筛选：例：由甲醇和甘氨酸合成高产丝氨酸菌株的筛选：首先筛选丝氨酸降解代谢障碍的首先筛选丝氨酸降解代谢障碍的TSTS突变株突变株然后排除然后排除C4C4二羧酸分解代谢障碍的二羧酸分解代谢障碍的TSTS突变株突变株5.2 5.2 温敏突变株的筛选方法温敏突变株的筛选方法1. 1. 温敏突变株在谷氨酸发酵中的应用温敏突变株在谷氨酸发酵中的应用5.3 5.3 温敏突变株在发酵工业中的应用温敏突变株在发酵工业中的应用2. 2. 温敏突变株在丝氨酸发酵中的应用温敏突变株在丝氨酸发酵中的应用5.3 5.3 温敏突变株在发酵工业中的应用温敏突变株在发酵工业中的应用3. 3. 微生物单细胞蛋白的生产微生物单细胞蛋白的生产优良菌种筛选的要求：优良菌种筛选的要求：富含蛋白质；富含蛋白质；生长迅速，底物利用率高；生长迅速，底物利用率高；菌体细胞壁易破碎，容易自溶；菌体细胞壁易破碎，容易自溶；细胞蛋白质中的蛋氨酸含量高，提高单细胞蛋白质的营养价值细胞蛋白质中的蛋氨酸含量高，提高单细胞蛋白质的营养价值5.3 5.3 温敏突变株在发酵工业中的应用温敏突变株在发酵工业中的应用第六节第六节 抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育噬菌体是寄生于微生噬菌体是寄生于微生物细胞内的一种病毒，物细胞内的一种病毒，其繁殖过程可分为：其繁殖过程可分为：对寄主的吸附、侵入、对寄主的吸附、侵入、增殖、成熟和裂解五增殖、成熟和裂解五个阶段。

个阶段 1. 1. 概念：概念：短时间内能连续完成生活史五个阶短时间内能连续完成生活史五个阶 段而实现繁殖和裂解寄主的噬菌体段而实现繁殖和裂解寄主的噬菌体2. 2. 分离和效价测定方法分离和效价测定方法(1) (1) 重层琼脂法重层琼脂法(2) (2) 单层平板法单层平板法(3) (3) 快速测定法快速测定法(4) (4) 斑点试验法斑点试验法6.1 6.1 烈性噬菌体及其效价的测定烈性噬菌体及其效价的测定1. 1.温和噬菌体概念：温和噬菌体概念：侵入宿主后，噬菌体侵入宿主后，噬菌体DNADNA只整合在宿只整合在宿主的染色体组上，并长期随宿主主的染色体组上，并长期随宿主DNADNA的复制而复制，在一般的复制而复制，在一般情况下不进行增殖和引起宿主细胞裂解情况下不进行增殖和引起宿主细胞裂解2. 2.溶源菌概念：溶源菌概念：核染色体上整合有前噬菌体并能正常生长繁核染色体上整合有前噬菌体并能正常生长繁殖而不被裂解的细菌殖而不被裂解的细菌6.1 6.1 温和噬菌体及溶源菌温和噬菌体及溶源菌3. 3. 溶源菌的显著特性：溶源菌的显著特性：(1) (1) 自发裂解：频率较低自发裂解：频率较低1010－－1 1～～1010－－4 4。

(2) (2) 诱导诱导(3) (3) 复愈复愈(4) (4) 免疫性免疫性(5) (5) 溶源转变溶源转变4. 4. 溶源菌的检验方法溶源菌的检验方法将少量溶源菌与大量敏感性指示菌混合后铺平板培养，可能产生将少量溶源菌与大量敏感性指示菌混合后铺平板培养，可能产生中央有溶源菌的小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑中央有溶源菌的小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑6.2 6.2 温和噬菌体及溶源菌温和噬菌体及溶源菌1. 1. 专一性噬菌体获得和纯化：选择因子专一性噬菌体获得和纯化：选择因子2. 2. 高效价噬菌体原液的制备高效价噬菌体原液的制备3. 3. 噬菌体原液效价测定：重层琼脂法噬菌体原液效价测定：重层琼脂法4. 4. 菌株诱发突变和分离菌株诱发突变和分离5. 5. 液体摇瓶振荡培养液体摇瓶振荡培养6. 6. 进一步考查抗性菌株对周围环境中存在的各种噬菌体的进一步考查抗性菌株对周围环境中存在的各种噬菌体的抗性抗性6.3 6.3 抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育1. 1. 抗性菌株稳定性试验抗性菌株稳定性试验菌株抗性产生的原因：菌株抗性产生的原因：基因突变引起细胞结构改变，使噬菌体难以吸附和入侵；基因突变引起细胞结构改变，使噬菌体难以吸附和入侵；细胞生理代谢的改变，即使噬菌体入侵，也不能在细胞内繁殖。

细胞生理代谢的改变，即使噬菌体入侵，也不能在细胞内繁殖实际工作中，有时会把细胞的溶源性引起的免疫性误认为抗性实际工作中，有时会把细胞的溶源性引起的免疫性误认为抗性区分方法：采用诱变因子诱导菌株，如果是溶源菌将释放噬菌体区分方法：采用诱变因子诱导菌株，如果是溶源菌将释放噬菌体2. 2. 抗性菌株的产量性能抗性菌株的产量性能6.4 6.4 抗性菌株的特性研究抗性菌株的特性研究1. 1. 菌种菌种金霉素链霉素金霉素链霉素849849号菌株号菌株2. 2. 培养基成分培养基成分3. 3. 噬菌体的分离纯化和原液制备噬菌体的分离纯化和原液制备4. 4. 噬菌体菌株的选育噬菌体菌株的选育5. 5. 菌株抗噬菌体性能的检验菌株抗噬菌体性能的检验6. 6. 摇瓶发酵试验摇瓶发酵试验7. 7. 发酵罐发酵试验发酵罐发酵试验6.4 6.4 抗噬菌体菌株选育实例抗噬菌体菌株选育实例小小 结结•试验设计和准备工作：了解出发菌株试验设计和准备工作：了解出发菌株•诱变育种的步骤与方法：出发菌株诱变育种的步骤与方法：出发菌株 诱变剂及诱变剂量诱变剂及诱变剂量 诱变剂的处理方式诱变剂的处理方式•突变株的分离与筛选：分离和筛选突变株的分离与筛选：分离和筛选 摇瓶液体培养摇瓶液体培养 产物活性测定产物活性测定 数据调整与分析数据调整与分析 培养基和培养条件的调整培养基和培养条件的调整•营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型菌株的筛选•温敏突变株的筛选温敏突变株的筛选•抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育。