【新编】重组克隆的筛选和鉴定讲义.ppt

第七章 重组克隆的筛选和鉴定 n内容提要 n第一节 载体表型选择法 n第二节 DNA电泳检测法 n第三节 核酸杂交检测法 n第四节 免疫化学检测法 n第五节 转译筛选法 n第六节 真核重组基因的选择方法 一般克隆与筛选策略 第一节 载体表型选择法 n根据载体提供的表型进行选择的方法 n抗生素抗性基因的插入失活选择法 n 半乳糖苷酶的显色反应选择法 一般原理 n一种利用抗生素抗性基因或其他基因的 插入失活 来筛选重组子的方法 n通常外源DNA插入的位点设计在特定基 因上 一旦外源DNA插入 该基因就被 破坏而失去活性 由此来判断载体上是 否带有外源DNA 一 插入失活法的原理 二 利用抗生素抗性基因 pBR322 n以pBR322为例 说明利用抗生素抗性基因的 插入失活的原理 1 原理 n在pBR322上有多个单一的限制酶位点 如 BamH I位点 恰好在一个四环素抗性基因内 如果有外源DNA插入BamH I位点 那么涉 及四环素抗性的基因就损坏 因此 带有重 组pBR322质粒的细胞 仍对氨苄青霉素有抗 性 但对四环素的抗性消失 敏感 2 筛选的方法 n 转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培 养基上 并培养至菌落出现 n 用一个牙签接触培养基的表面 将沾有不 同菌落的牙签 放到另一含有四环素的固体 培养基表面接触一下 n 适温培养 有的克隆生长 有的不生长 n 根据不会生长的位置 再回到带氨苄的培 养基上去找那些原始的克隆 n 这些克隆因为丧失了对四环素的抗性 就 是含有重组pBR322质粒的重组子 图 pBR322的结构图 3 抗菌素标记的选择 1 Ampr 氨苄青霉素抗性基因 n产生 内酰胺酶 酶使氨苄青霉素变为青霉 酮酸 青霉酮酸使蓝灰色的碘 青霉素指示液 I2 KI Aampicillin 褪色 nAmpr有Pst I Sca I等多个插入位点 2 四环素 n抑制细菌生长 但不杀死细菌 3 环丝氨酸 n杀死生长的细菌 但不杀停止生长的细菌 4 选择的过程 1 四环素抗性插入失活 n如果在Tetr上插入外源DNA 导致四环 素抗性基因失活 可用四环素 环丝氨 酸的平板 选择重组克隆 nTetr插入失活的细菌 其生长可被四环 素抑制 不被环丝氨酸杀死 保留下来 nTetr不失活的细菌 能抗四环素 正常 生长 但可被环丝氨酸杀死 无环丝氨酸 图 四环素抗性插入失活 重组克隆 2 氨苄青霉素抗性插入失活 n氨苄青霉素抗性基因编码产生 内酰胺 酶 酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸 青 霉酮酸使蓝灰色的碘 青霉素指示液褪 色 n如果Ampr上插入外源DNA 导致氨苄 青霉素抗性基因失活 就不能使碘 青 霉素指示液褪色 呈蓝灰色 据此选择 阳性克隆 图 氨苄青霉素抗性插入失活 三 利用 半乳糖苷酶显色 n选择重组子的原理 1 半乳糖苷酶与Lac Z基因 n由E coli lac操纵子上的Lac Z基因编码 分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖 2 Lac Z 基因 n突变的Lac Z基因 只编码 半乳糖苷 酶的部分肽段 氨基端 2 培养基中IPTG X gal 的作用 1 IPTG作用 n异丙基硫代 D 半乳糖苷是诱导物 可诱导 lacZ 基因的表达 半乳糖苷酶 2 X gal作用 n5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷 作为 半乳 糖苷酶水解的底物 3 X gal的显色反应 n 半乳糖苷酶 四聚体 将X gal水解成半乳糖 苷和蓝色的吲哚衍生物 靛蓝 在4 蓝色加 深 n 互补作用是pUC质粒载体的特性 npUC载体 含有Lac Z 基因 编码 半乳糖苷 酶的部分肽段 片段 氨基端 n受体菌 基因组中带有突变的 半乳糖苷酶 基因 缺失 片段 可被IPTG诱导表达 只编码 半乳糖苷酶的 肽 n载体和受体菌基因组互补 只有当受体菌吸 收了带有LacZ 基因的 pUC质粒 才能合成完 整的有活性的 半乳糖苷酶 3 互补作用 n氨苄青霉素抗性基因 nLac Z 基因 编码 半乳糖苷酶的部分 肽段 nLac Z 上有插入外源DNA的MCS位点 pUC18 19的结构图 n利用蓝白斑法筛选pUC8 9重组子 是一 种直接检测 半乳糖苷酶活性的方法 n 先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培 养基 能合成 半乳糖苷酶 n 然后再通过检测 半乳糖苷酶的活性 来选择重组子 如果既能抗氨苄青霉 素 又能合成 半乳糖苷酶的细胞 就 是重组子细胞 4 筛选的方法 蓝白斑法 n 半乳糖苷酶分解X gal的显色反应很 灵敏 当在含有氨卡青霉素 X gal IPDG的培养基中 那些能合成完整的 半乳糖苷酶的非重组子克隆 会因它 能分解X gal而变成蓝色 而重组子 克隆因Lac Z 基因被破坏 不能合成完 整的 半乳糖苷酶 故不能分解X gal而 呈白色 5 选择培养的原理 n在含有X gal 和IPTG 的选择培养基上 载体上没有插入片段的转化子为蓝色菌 落 而携带插入片段的重组质粒转化子 为白色菌落 n平板37 培养后 放于冰箱3 4 小时 可使显色反应充分 菌落为蓝色 图 半乳糖苷酶显色反应 半乳 糖苷酶 乳糖 半乳糖葡萄糖 X gal 半乳糖5 溴 4 氯靛蓝 蓝色 图 LacZ 插入外源DNA 图 白色菌落与蓝色菌落的挑选 四 pBS重组质粒的筛选实验 n使用的载体为pBS质粒 n转化受体菌为E coli DH5 菌株 n由于pBS上带有Ampr 和lacZ 基因 故 重组子的筛选采用Amp 抗性筛选与 互 补现象筛选相结合的方法 载体 n 供体为羧基末端缺失的 半乳糖苷酶 如pUC pGEM系列载体 菌株 n 受体为氨末端缺失的 半乳糖苷酶 如DH5 LacZ M15 JM101 110 LacZ M15 等 1 抗性筛选 n因pBS质粒带有Ampr 基因 而外源 DNA片段上不带该基因 故转化受体菌 后 只有带有pBS DNA 的转化子 才 能在含有Amp 的LB 平板上存活下来 而只带有自身环化的外源DNA片段的转 化子则不能存活 此为初步的抗性筛选 2 lacZ 基因的插入失活 npBS质粒上带有 半乳糖苷酶基因的调 控序列和 半乳糖苷酶N 端146 个氨基 酸的编码序列 该编码区有一个多克隆 位点 但并不破坏lacZ 的阅读框架 不 影响其正常功能 3 DH5 菌株 nE coli DH5 菌株带有 半乳糖苷酶的C 端的部分编码序列 n在各自独立的情况下 pBS 和DH5 编 码的 半乳糖苷酶的片段都没有酶活性 但在pBS 和DH5 融为一体时 可形 成具有 半乳糖苷酶活性的蛋白质 4 互补现象 nlacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变 体与带有完整的近操纵基因区段的 半 乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现 象 n由 互补产生的Lac 细菌较易识别 它在生色底物X gal 存在下 被IPTG 诱 导 形成蓝色菌落 n当外源DNA片段插入到pBS 质粒的多克 隆位点后 导致读码框架改变 表达蛋 白失活 产生的肽段失去 互补能力 因此 在同样条件下 含重组质粒的转 化子 在生色诱导培养基上 只能形成 白色菌落 互补作用 现象 n当pUC质粒转化LacZ基因的氨基未端编 码序列缺失的Lac 指示菌株时 能恢复 半乳糖苷酶活性 从而在含IPTG和X gal的平板上 分解X gal成5 溴 4 氯靛 蓝 出现蓝色菌落的现象 n当外源DNA插入pUC的MCS时 互补 作用被破坏 在IPTG和X gal平板上则 不显蓝色而出现白色菌落 第三节 DNA电泳检测法 PFGE n从转化后的克隆 转化子 中快速抽提 重组质粒 琼脂糖凝胶电泳比较其分子 量大小 n插入外源DNA的重组质粒分子量大 没 有插入外源DNA的质粒分子量小 n比较不同质粒在凝胶中的迁移率 迁移 快慢不同 即可选出重组子 一 直接电泳检测法 Marker 载体重组 图 琼脂糖凝胶电泳图谱的比较 已知未知 二 酶切产物电泳筛选法 n1 原理 n根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱 选择1 2种内切酶切割质粒 电 泳后比较DNA带数和长度 n或用一种内切酶切下插入片段 再用另 一种酶酶切这个片段 电泳后比较两者 是否符合预计的结果 图 酶切产物的电泳筛选 图 限制性内切酶酶切图谱 图 表型筛选加酶切筛选 n A A T T A AT T 三 PCR扩增检测法 1 原理 n在模板序列上扩增出预期DNA片断 2 过程 1 从重组克隆中提取质粒 或DNA 2 用插入的DNA片段的引物作PCR 3 PCR产物电泳检查 4 PCR产物的长度是否与外源基因一致 第四节 核酸的分子杂交 n核酸杂交技术由Hall Nygaard等于70 年代建立 应用DNA或RNA探针 与 靶序列在溶液中杂交 检测固定在硝酸 纤维素 NC 膜上的核酸序列的技术 n核酸杂交法利用标记的核酸探针 与转 化细胞的DNA进行杂交 可以直接筛选 和鉴定目的序列克隆 n常用的方法 将转化后生长的菌落 复 印到硝酸纤维膜上 再用碱裂细菌菌落 释放的DNA就吸附在膜上 再与标记 的核酸探针温育杂交 核酸探针就结合 在含有目的序列的菌落DNA上 n该技术已广泛应用于基因的表达 基因 定位 克隆基因的筛选 酶切图谱的制 作 基因组中特定基因序列检测 遗传 病疾病的诊断及生物分类等方面 一 核酸分子杂交的基础 1 变性与退火 nDNA以双链形式存在 在进行分子杂交 时 先将双链DNA分子解聚为单链 这 一过程称为变性 n两条单链通过碱基互补 聚合成稳定的 双链区的过程称为退火或复性 2 同源序列 n不同来源的核酸单链只要彼此之间有一 定程度的互补顺序 即某种程度的同源 性 就可形成杂交双链 n分子杂交可在DNA与DNA Southern blot RNA与DNA Northern blot 或RNA与RNA In situ 的二条单链之 间进行 3 分子杂交法 n分子杂交是通过一定方法 将核酸分子 固定在固相支持物上 然后用放射性标 记的探针与被固定的核酸分子杂交 经 显影后 显示出目的DNA或RNA所处 的位置 n分子杂交就是将一种核酸单链用同位素 或非同位素标记成为探针 再与另一种 核酸单链进行杂交 4 探针 n经过同位素或非同位素标记的已知序列 的寡核苷酸 n单一的已知序列的寡核苷酸探针 能与 它们的目的序列配对 可以准确地设计 杂交条件 以保证探针只与目的序列杂 交而不与序列相近的非完全配对序列杂 交 对于一些未知序列的目的片段则无 效 5 杂交的灵敏度和特异性 n核酸分子杂交具有高度的灵敏度和特异 性 n可以根据所使用的探针的已知序列 进 行特异性的靶序列检测 二 探针的类型 n根据核酸的性质 可分为 nDNA探针 RNA探针 cDNA探针和寡核酸 探针 n根据是否使用放射性标记物 可分为 n放射性标记探针和非放射性标记探针 n根据是否存在互补链 可分为 n单链和双链探针 n根据放射性标记物掺入情况 可分为 n均匀标记和末端标记探针 1 双链DNA探针 n双链DNA探针的合成方法 n主要有两种 n 切口平移法 n 随机引物合成法 2 单链DNA探针 n单链DNA探针主要有两种合成方法 n 以M13载体衍生序列为模板 用 Klenow片段合成单链探针 n 以RNA为模板 用反转录酶合成单链 cDNA探针 3 末端标记DNA探针 n以Klenow片段标记3 末端为例说明末端 标记的方法 4 寡核苷酸探针 n利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单 个核苷酸的点突变 n常用的寡核苷酸探针主要有两种 n单一已知序列的寡核苷酸探针 n许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷 酸探针库 三 探针的标记方法与选择 1 探针标记的方法 n 缺口平移法 n DNA快速末端标记 n T4多核苷酸激酶标记DNA 5 末端法 n 随机引物延伸法 n 聚合酶链反应法 2 标记方法的选择 n根据实验的要求如灵敏度和显示方法等 选 择合适的标记方法 n 一般放射性探针比非放射性探针的灵敏度 高 n 在检测单拷贝基因序列时 应选用标记效 率高 显示灵敏的探针标记方法 n 在对。