《微生物遗传》PPT课件.ppt

微生物遗传与变异微生物遗传与变异 要点：要点：1、细菌基因重组的原理和方法细菌基因重组的原理和方法2、真菌基因重组的原理和方法真菌基因重组的原理和方法3、微生物诱变育种的原理和方法微生物诱变育种的原理和方法4、基因工程的基本原理、基因工程的基本原理5、基因表达的调控、基因表达的调控重点：重点：细菌的基因重组细菌的基因重组难点：难点：低频转导，高频转导，准性生殖低频转导，高频转导，准性生殖 第一节第一节  遗传的物质基础遗传的物质基础第二节第二节   微生物的基因组结构微生物的基因组结构第四节第四节  真核微生物的基因重组真核微生物的基因重组 第三节第三节  原核微生物的基因重组原核微生物的基因重组第五节第五节  基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种第六节第六节  微生物与基因工程微生物与基因工程三个经典实验的原理与方法，三个经典实验的原理与方法，朊病毒的概念朊病毒的概念原核及真核微生物基因组的基本特征原核及真核微生物基因组的基本特征基因突变的规律基因突变的规律三种基因水平转移方式及其应用三种基因水平转移方式及其应用准性生殖准性生殖基因工程的基本过程和基本技术基因工程的基本过程和基本技术遗传：遗传： 亲代与子代相似亲代与子代相似变异变异： 亲代与子代、子代间不同个体不完全相同亲代与子代、子代间不同个体不完全相同遗传（遗传（inheritance））和变异（和变异（variation））是生命的最本质特性之一是生命的最本质特性之一遗传型遗传型：(genotype)表型表型：(phenotype)决定生物表现型的遗传因子决定生物表现型的遗传因子具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。

和表型是由遗传型所决定，但也和环境有关表型是由遗传型所决定，但也和环境有关遗传型＋环境条件遗传型＋环境条件表型表型表型饰变：表型饰变：同样遗传型的生物在不同外界条件下显现的不同表现同样遗传型的生物在不同外界条件下显现的不同表现型的变异，不涉及遗传物质结构改变型的变异，不涉及遗传物质结构改变特点：特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为遗传型改变引起的表型变化，发生在基因水平上，可遗传型改变引起的表型变化，发生在基因水平上，可以遗传给子代以遗传给子代特点：特点：遗传性、群体中极少数个体的行为遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常（自发突变频率通常为为1010-6-6-10-10-9-9））遗传型变异（基因突变）遗传型变异（基因突变）：第一节第一节 遗传的物质基础遗传的物质基础★★一一. .证明核酸是遗传物质的经典实验证明核酸是遗传物质的经典实验①①1928年年 ，， F. Griffith；； 1944年年 O. T. Avery 肺肺 炎炎 链链 球球 菌菌（（Streptococcus pneumoniae））转化试验转化试验。

②②1952年，年，A. D. Hershy、、M. Chase的的噬菌体感染实验噬菌体感染实验③③1956年，年，H. Fraenkel-Conrat的的TMV拆开和重建实验拆开和重建实验1 1、经典转化实验、经典转化实验肺炎链球菌：肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）•①①加加S菌菌DNA•②②加加S菌菌DNA及及DNA酶以外的酶酶以外的酶•③③加加S菌的菌的DNA和和DNA酶酶•④④加加S菌的菌的RNA•⑤⑤加加S菌的蛋白质菌的蛋白质•⑥⑥加加S菌的荚膜多糖菌的荚膜多糖活活R菌菌长出长出S菌菌只有只有R菌菌1944年年 Avery、、 MacLeod和和 McCarty从从 热热 死死 S型型 S. pneumoniae中中提提纯纯了了可可能能作作为为转转化化因因子子的的各各种种成成分分，，并并在离体条件下进行了转化试验：在离体条件下进行了转化试验：只只有有S型型细细菌菌的的DNA才才能能将将S. pneumoniae的的R型型转转化化为为S型型。

且且DNA纯纯度度越越高高，，转转化化效效率率也也越越高高说说明明S型型菌菌株株转转移给移给R型菌株的，是遗传因子型菌株的，是遗传因子DNA2、噬菌体感染实验、噬菌体感染实验进入细菌细胞内部的物质是进入细菌细胞内部的物质是DNADNA包含有产生完整噬菌包含有产生完整噬菌体的全部信息体的全部信息3、植物病毒、植物病毒TMV重建实验重建实验TMV的遗传物质是的遗传物质是RNA结论：Ø 证明核酸（证明核酸（DNA或或RNA）是遗传的物质基）是遗传的物质基础础Ø简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题题Ø微生物与高等生物具有共同的遗传本质微生物与高等生物具有共同的遗传本质朊病毒的发现和思考朊病毒的发现和思考:朊病毒朊病毒一种具有传染性的蛋白质致病因子一种具有传染性的蛋白质致病因子蛋白质是遗传物质吗蛋白质是遗传物质吗蛋白质折叠与功能的关系，蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？是否存在折叠密码？？？？？？？已知的传染性疾病的传播因已知的传染性疾病的传播因子必须含有核酸子必须含有核酸①①真核生物真核生物•DNADNA分分子子与与组组蛋蛋白白结结合合构构成成染染色色体体，，每每条条染染色色体体有有单单一一线线性性双双链链DNADNA分分子子。

一一个个真真核核生生物物细细胞胞内内有有多多条条染染色色体体（（脉脉孢孢菌菌7 7条条，，人人2323条条））高高等等生生物物中中有有2 2至至多多套套染染色色体体（（动动物物2 2倍倍，，水水稻稻4 4倍倍）），，真真菌菌有有双双倍倍体体，，但但多多数数微微生生物物是是单单倍倍体体真真核核细细胞胞核核物物质质外有核膜包围，形成完整细胞核外有核膜包围，形成完整细胞核②②原核生物原核生物•DNADNA不与组蛋白结合，染色体仅由一条不与组蛋白结合，染色体仅由一条DNADNA组成，组成，DNADNA为共价闭为共价闭合环状双链，一个细胞内只有一条染色体（单倍体合环状双链，一个细胞内只有一条染色体（单倍体haploidhaploid）无核膜包围，只在细胞中央形成核区无核膜包围，只在细胞中央形成核区③③质粒质粒plasmidplasmid和和转座因子转座因子•原原核核生生物物中中，，除除染染色色体体以以外外，，能能够够自自主主复复制制的的共共价价闭闭合合环环状状DNADNA分分子子它它们们携携带带少少量量遗遗传传基基因因，，决决定定细细胞胞的的某某些些性性状状，，并并非细菌生活必需非细菌生活必需二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和形式二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和形式一）遗传物质在微生物细胞中的存在方式一）遗传物质在微生物细胞中的存在方式真核微生物：细胞核真核微生物：细胞核原核微生物：核区原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的（二）遗传物质存在的部位（二）遗传物质存在的部位细胞核水平细胞核水平真核生物真核生物             细胞核细胞核             核染色体核染色体原核生物原核生物             核区核区             DNA链链核基因组核基因组在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质核外染色核外染色体体真真核核生生物物的的“质质粒粒”原原核核生生物物的质粒的质粒线粒体线粒体细胞质基因细胞质基因叶绿体叶绿体（质体）（质体）中心体中心体动动    体体共生生物：共生生物：卡巴颗粒卡巴颗粒酵母菌的酵母菌的2 m质粒质粒F因子因子R因子因子Col质粒质粒Ti质粒质粒巨大质粒巨大质粒降解性质粒降解性质粒核基因组核基因组遗遗传传物物质质类类型型（三）转座因子（三）转座因子（（（（transposibletransposible element element））））细胞中能改变自身位置（例如从染色体或质粒转移到另一个位点，细胞中能改变自身位置（例如从染色体或质粒转移到另一个位点，或者在两个复制子之间转移）的一段或者在两个复制子之间转移）的一段DNA序列。

序列也称也称跳跃基因跳跃基因（（jumping gene））或或可移动基因（可移动基因（movable gene）插入序列（插入序列（insertion sequence,IS)转座子（转座子（transposon ,Tn)某些病毒（某些病毒（Mu噬菌体）噬菌体）原核生物的转座因子：原核生物的转座因子：转座因子转座因子•4040年代年代McClintockMcClintock在在玉米中发现了转座子即跳跃基玉米中发现了转座子即跳跃基因因，自，自19671967年以来，已在微生物和其它生物中得到年以来，已在微生物和其它生物中得到普遍证实普遍证实•新发现新发现：：：：有些有些DNADNA片段不但可在染色体上移动，还片段不但可在染色体上移动，还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒跳可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒跳到另一个质粒或染色体，甚至还从一个细胞转移到到另一个质粒或染色体，甚至还从一个细胞转移到另一个细胞在这些另一个细胞在这些DNADNA顺序的跳跃过程中，往往顺序的跳跃过程中，往往导致导致DNADNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或使链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生。

某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生转座因子的种类（转座因子的种类（1））•插入序列（插入序列（IS，，insertion sequence））：分子量最小（仅：分子量最小（仅0.7-1.4kb），），只能引起转座（只能引起转座（transposition））效应而不效应而不含其它基因可以在染色体、含其它基因可以在染色体、F因子等质粒上发现它们因子等质粒上发现它们•已知的已知的IS有有5种，即种，即 IS1、、IS2、、IS3、、IS4和和IS5•因因IS在染色体上插入的位置和方向的不同，其引起的突变在染色体上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同效应也不同IS引起的突变可回复，其原因可能是引起的突变可回复，其原因可能是IS被切被切离，如果因切离部位有误而带走离，如果因切离部位有误而带走IS以外的一部分以外的一部分DNA序列，序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变转座因子的种类（转座因子的种类（2））•转座子转座子(Tn，，transposon，，又称转位子，易位子又称转位子，易位子)与与IS和和Mu噬菌体相比，噬菌体相比，Tn的分子量居中（一般为的分子量居中（一般为2~25kb）。

它含有几个至十几个基因，其中除了它含有几个至十几个基因，其中除了与转座有关的基因外，还含有抗药基因或乳糖发与转座有关的基因外，还含有抗药基因或乳糖发酵基因等其它基因酵基因等其它基因•Tn虽能插到受体虽能插到受体DNA分子的许多位点上，但这些分子的许多位点上，但这些位点似乎也不完全是随机的，其中某些区域更易位点似乎也不完全是随机的，其中某些区域更易插入•特征：在两端有特征：在两端有IRIR序列序列 ，分两类：，分两类：•ⅠⅠ型型Compound transposons：：两端为两端为插入序列插入序列IS，，抗性基因居中抗性基因居中如如Tn5、、Tn9、、Tn10、、Tn4001、、Tn4003•ⅡⅡ型型Complex transposons：：两端为两端为IR(30-50bp)，，中间为转座基因和抗性基因中间为转座基因和抗性基因如如Tn1、、Tn3、、Tn21、、Tn1721、、Tn551转座子转座子  transposon转座因子的种类（转座因子的种类（3））•Mu噬菌体（即噬菌体（即 mutator phage，，诱变噬菌体）诱变噬菌体） 是是E . coli的一种温和噬菌体。

与必须整合到宿的一种温和噬菌体与必须整合到宿主染色体特定位置上的一般温和噬菌体不同，主染色体特定位置上的一般温和噬菌体不同，Mu噬噬菌体并没有一定的整合位置菌体并没有一定的整合位置•与与IS和和Tn相比，相比，Mu噬菌体的分子量最大噬菌体的分子量最大37kb，含，含有有20多个基因引起的转座可以导致插入突变，其多个基因引起的转座可以导致插入突变，其中约有中约有2%是营养缺陷型突变是营养缺陷型突变转座的遗传学效应：转座的遗传学效应：1）插入突变）插入突变2）产生染色体畸变）产生染色体畸变3）基因的移动和重排）基因的移动和重排四）质粒四）质粒1、、致育因子致育因子(Fertility factor，，F因子因子)3、、产细菌素的质粒（产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid））2、、抗性因子（抗性因子（Resistance factor，，R因子）因子）4、、毒性质粒（毒性质粒（virulence plasmid））5、、代谢质粒（代谢质粒（Metabolic plasmid））6、、隐秘质粒（隐秘质粒（cryptic plasmid））DNA→RNA→→RNA→肽链肽链→蛋白质蛋白质五）基因的表达五）基因的表达第二节：微生物的基因组结构•明确基因组的概念，微生物在人类基因组计划中的独特而明确基因组的概念，微生物在人类基因组计划中的独特而重要的地位；重要的地位；• 人类基因组计划对微生物学发展的影响；人类基因组计划对微生物学发展的影响；•三种代表性微生物基因组结构的特点，特别强调古生菌基三种代表性微生物基因组结构的特点，特别强调古生菌基因组的独特性及双重特征；因组的独特性及双重特征；•随着基因组全序列测定微生物的增多所发现的新问题：随着基因组全序列测定微生物的增多所发现的新问题： 水平基因转移现象水平基因转移现象 Woese系统发育树面临的挑战系统发育树面临的挑战 微生物基因组结构的特点微生物基因组结构的特点1、原核生物（细菌）的基因组、原核生物（细菌）的基因组1）染色体为）染色体为双链环状的双链环状的DNA分子（单倍体）；分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；）基因组上遗传信息具有连续性；         基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数        一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。

一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的 3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；）功能相关的结构基因组成操纵子结构； 4）结构基因的单拷贝及）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；基因的多拷贝； 5）基因组的重复序列少而短）基因组的重复序列少而短.基因组基因组genome：：一种生物的全套基因一种生物的全套基因2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组、真核微生物（啤酒酵母）的基因组1））典型的真核染色体结构；典型的真核染色体结构；啤酒酵母基因组大小为啤酒酵母基因组大小为13.5×106bp，，分布在分布在16条染色体中条染色体中 2）没有明显的操纵子结构；）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）或内含子序列；）有间隔区（即非编码区）或内含子序列； 4））最显著的特点是最显著的特点是重复序列多重复序列多. 第一个完成基因组测序的真核生物基因组第一个完成基因组测序的真核生物基因组•基因组上有许多较高同源性的基因组上有许多较高同源性的 DNA 重复序列，重复序列，这是一种进化即可在少数基因发生突变而失去这是一种进化即可在少数基因发生突变而失去功能时不会影响生命过程，也可适应复杂多变的功能时不会影响生命过程，也可适应复杂多变的环境，丰余的基因可在不同的环境种起用多个功环境，丰余的基因可在不同的环境种起用多个功能相同或相似的基因产物，有备无患。

能相同或相似的基因产物，有备无患•酵母菌确实比细菌和病毒进步而富有，而细菌和酵母菌确实比细菌和病毒进步而富有，而细菌和病毒似乎更聪明，能更经济更有效地利用遗传资病毒似乎更聪明，能更经济更有效地利用遗传资源2、古生菌（詹氏甲烷球菌）的基因组、古生菌（詹氏甲烷球菌）的基因组第一个完成基因组测序的古生菌第一个完成基因组测序的古生菌1)只有只有40％的基因与其他两界的生物有同源性％的基因与其他两界的生物有同源性2)古生菌的基因组在结构上类似于细菌古生菌的基因组在结构上类似于细菌3)            1.66x106bp的环状染色体的环状染色体DNA4)            1682个个ORF(Open Reading Frame)5)3)  负责信息传递功能的基因（复制负责信息传递功能的基因（复制 、转录和翻译）则类、转录和翻译）则类似于真核生物似于真核生物克隆克隆cloneclone不经过有性细胞的结合，由体细胞发育成新个体，即无性繁殖不经过有性细胞的结合，由体细胞发育成新个体，即无性繁殖基因重组基因重组gene recombination•两两个个不不同同来来源源的的遗遗传传物物质质进进行行交交换换，，经经过过基基因因的的重重新新组组合合，，形形成成新新的的基基因因型型的的过过程程。

重重组组获获得得的的后后代代具具有有新新的的基基因因组组合合，，表表现出不同于亲本的新性状现出不同于亲本的新性状•原原核核微微生生物物没没有有有有性性生生殖殖，，其其基基因因重重组组通通过过转转化化、、接接合合、、转导转导方式进行方式进行第三节第三节 原核微生物的基因重组原核微生物的基因重组一、细菌的接合作用(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程过程1.实验证据实验证据接合接合(conjugation)通过供体菌与受体菌间细通过供体菌与受体菌间细胞接触而传递大段胞接触而传递大段DNA1946年，年，Joshua Lederberg 和和Edward L.TatumE.coli k12的多重营养缺陷型杂的多重营养缺陷型杂交实验交实验中间平板上长出的原养型菌落中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致和重组所致F因子因子•大肠杆菌是有性别分化的决定它们性别的因大肠杆菌是有性别分化的决定它们性别的因子称为子称为F F因子因子( (致育因子或称性质粒致育因子或称性质粒) )，呈超，呈超螺旋状态，螺旋状态，既可以在细胞内独立存在既可以在细胞内独立存在, 具有自主具有自主的与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中的与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中的能力的能力, ,也可插入也可插入( (即整合即整合) )到染色体上到染色体上F F因子的四种细胞形式：因子的四种细胞形式： a））F-菌株菌株(“雌性雌性”菌株菌株)，，不含不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收合作用接收F因子而变成因子而变成F+菌株菌株；；b））F+菌株菌株(“雄性雄性”菌株菌株)，， F因子因子独立存在，细胞表面有性菌毛。

独立存在，细胞表面有性菌毛c c））HfrHfr菌株菌株，，F F因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上上，细胞表面有性菌毛细胞表面有性菌毛d d））F′F′菌株菌株，，Hfr菌株内的菌株内的F因子因因子因不正常切割而脱离染色体时，形成不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为因子，特称为F′因因 子 细胞表面同细胞表面同样有性菌毛样有性菌毛•F+F+菌株菌株含含F F质粒，细胞表面产生性毛质粒，细胞表面产生性毛( (sex sex pilipili) )，，与与F-F-细胞相连，在细胞相连，在接合后转移接合后转移DNADNA •F-F-菌株菌株无无F F质粒，不产生性毛，可接受外来质粒，不产生性毛，可接受外来F F质粒•Hfr菌株菌株•高频重组菌株（高频重组菌株（high frequency recombination）与与F-接合后，重组频率接合后，重组频率比比F+高几百倍高几百倍•在在Hfr细胞中，存在与染色体特定位点相整合的细胞中，存在与染色体特定位点相整合的F因子因子(产生频率约产生频率约10-5)当它与当它与F-菌株发生接合时，菌株发生接合时，Hfr染色体在染色体在F因子处发生断裂，由环状变成线因子处发生断裂，由环状变成线状。

整段线状染色体转移至状整段线状染色体转移至F-细胞的全过程约需细胞的全过程约需100 min在转移时，由于在转移时，由于断裂发生在断裂发生在F因子中，所以必然要等因子中，所以必然要等Hfr的整条染色体组全部转移完成后，的整条染色体组全部转移完成后，F因子才能完全进入因子才能完全进入F-细胞但转移过程中断，所以越在前端的基因，进细胞但转移过程中断，所以越在前端的基因，进入的机会就越多，故在入的机会就越多，故在F-中出现重组子的时间就越早，频率也高中出现重组子的时间就越早，频率也高•F’F’菌株菌株•当当HfrHfr菌株内的菌株内的F F因子因不正常切割而脱离其染色体组时，可因子因不正常切割而脱离其染色体组时，可形成游离的携带一小段染色体基因的形成游离的携带一小段染色体基因的F F因子，特称因子，特称F’F’因子因子•携带有携带有F’F’因子的菌株，其性状介于因子的菌株，其性状介于F+F+与与HfrHfr之间，这就是初之间，这就是初生生F’F’菌株初生菌株初生F’F’菌株与菌株与F-F-菌株接合，可使后者转变成菌株接合，可使后者转变成F’F’菌株，这就是次生菌株，这就是次生F’F’菌株，它既获得了菌株，它既获得了F F因子，又获得因子，又获得了来自初生了来自初生F’F’菌株的若干遗传性状。

以这种接合来传递供菌株的若干遗传性状以这种接合来传递供体菌基因的方式，称为体菌基因的方式，称为F F因子转导因子转导( (F-F-ductionduction) )、、性导性导( (sexductionsexduction) ) •在次生的在次生的F’F’群体中，大约有群体中，大约有10%10%的的F’F’因子重新整合到染色因子重新整合到染色体组上，而恢复成体组上，而恢复成HfrHfr菌1）） F+×F-杂交杂交1 1））F F+ +细菌通过性毛与细菌通过性毛与F F- -细菌接触并发生相互作用；细菌接触并发生相互作用；2 2））F F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F F因子的一条链到因子的一条链到F F- -细菌中 3 3））F F因子的一条链一进入因子的一条链一进入F F- -细菌中，在细菌中，在F F- -细菌中复制新的细菌中复制新的 F F因子从而变成因子从而变成F F+ + 4 4））原有原有F F+ +细胞也完成细胞也完成F F因子另一条链的复制，所以转移是因子另一条链的复制，所以转移是F F+ +的拷贝F+ ＋＋ F+ HfrHfr菌株的菌株的F F因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上，因此上，因此只要发只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给色体传递给F F- -细胞并发生重组，由此而得名为细胞并发生重组，由此而得名为高高频重组菌株频重组菌株2 2））HfrHfr ×F-杂交杂交Hfr菌株仍然保持着菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有细胞的特征，具有F性菌毛，性菌毛，并象并象F+一样与一样与F-细胞进行接合。

细胞进行接合所不同的是，当所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，生缺口后，F因子的先导区因子的先导区(leading region)结合结合着染色体着染色体DNA向受体细胞转移向受体细胞转移F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中因子不易转入受体细胞中Hfr×F-杂交后的受体细胞杂交后的受体细胞(或接合子或接合子)大多数仍然大多数仍然是是F-染色体上越靠近染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，中出现重组子的的时间就越早，频率也高频率也高HfrHfr＋＋ F-3 3））F′F′×F F-杂交杂交F′×F-与与F+×F-的不同：的不同：供体的部分染色体基因随供体的部分染色体基因随F′一起转一起转入受体细胞入受体细胞a））与染色体发生重组；与染色体发生重组；b））继续存在于继续存在于F′因子上，形成一种因子上，形成一种部分二倍体部分二倍体细胞基因的这种转移过程又常称为细胞基因的这种转移过程又常称为性导（性导（sexduction）。

F′F′＋＋ F′ F′1、普遍性转导（、普遍性转导（generalized transduction））(1) 意外的发现19511951年，年，Joshua LederbergJoshua Lederberg和和Norton Norton ZinderZinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌进行进行类似的实验：类似的实验：用用“U U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！现原养型细菌！二、细菌的转导二、细菌的转导( (transduction)transduction)•1952 1952 年年Zinder 和和 Lederberg 在验证在验证Salmonella typhimurium是否也存在接合是否也存在接合现象时发现了转导现象现象时发现了转导现象•S. typhimurium：：LT22A (trp-)；； LT2(his-)•LT22溶原性溶原性→噬菌体噬菌体P22→ 感染感染LT2（（非溶原性）非溶原性）→可能释放带可能释放带trp+的的P22→LT22A (trp-)→呈原养型。

呈原养型沙门氏菌沙门氏菌LT22A是携带是携带P22噬菌体的溶源性细菌噬菌体的溶源性细菌, 另另一株是非溶源性细菌一株是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的型管滤板的P22噬菌体介导的噬菌体介导的（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）Why and How ?（二）转导（（二）转导（transduction））转导：转导：由病毒介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式由病毒介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式 一个细胞的一个细胞的DNA或或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中细菌转导的类型：细菌转导的类型：普遍普遍转导转导局限局限转导转导完全完全转导转导流产转导流产转导低频低频转导转导高频转导高频转导转导噬菌体：转导噬菌体：能将细菌宿主的部分染色体和质粒能将细菌宿主的部分染色体和质粒DNA带到另一个细带到另一个细菌的噬菌体菌的噬菌体。

获得了由噬菌体携带来的供体菌获得了由噬菌体携带来的供体菌DNA片段的受体细胞片段的受体细胞称为称为转导子转导子在转导中被转移的染色体片段称为在转导中被转移的染色体片段称为转导因子转导因子 普遍转导（普遍转导（generalized transduction））噬菌体可以转导噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分供体菌染色体的任何部分到受体细胞中到受体细胞中普遍性转导的三种后果：普遍性转导的三种后果：外源外源DNA被降解，转导失败被降解，转导失败进入受体的外源进入受体的外源DNA通过通过与细胞染色体的重组交换与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子而形成稳定的转导子流产转导流产转导完全完全转导转导complete transduction ：：   形成了遗传性稳定的转导子形成了遗传性稳定的转导子(transductant)•普遍转导普遍转导(generalized transduction)•噬菌体可误包供体菌中的任何基因噬菌体可误包供体菌中的任何基因( (包括质粒包括质粒) )，并使受体菌，并使受体菌实现各种性状的转导实现各种性状的转导        转导转导DNA不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。

因此群体中仅一个细胞含有经过转录而得到表达因此群体中仅一个细胞含有DNA，，而其而其它细胞只能得到其基因产物它细胞只能得到其基因产物流产转导：流产转导：局限转导：局限转导：温和噬菌体感染温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体割而连在噬菌体DNA上上部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中转移到受体菌中•局限转导局限转导specialized transduction•当溶原菌群经诱导后，其中极少数前噬菌体从宿主染色体脱落当溶原菌群经诱导后，其中极少数前噬菌体从宿主染色体脱落时产生错误切割，从而把宿主的某些基因（时产生错误切割，从而把宿主的某些基因（ λλ前噬菌体位点前噬菌体位点两端是细菌染色体的两端是细菌染色体的gal＋＋和和bio＋＋，，故形成的转导噬菌体通常故形成的转导噬菌体通常带有带有ga1＋＋或或bio＋＋））整合到噬菌体的基因组上整合到噬菌体的基因组上 ，当这样的噬，当这样的噬菌体侵染另一宿主菌时，噬菌体菌体侵染另一宿主菌时，噬菌体 DNA DNA 与受体菌的与受体菌的 DNA DNA 同源区同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上，使受体菌段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上，使受体菌获得了供体的这部分遗传特性，而形成转导子（缺陷溶源菌）。

获得了供体的这部分遗传特性，而形成转导子（缺陷溶源菌）局限转导与普遍转导的主要区别：局限转导与普遍转导的主要区别：a））局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，连接，与噬菌体与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因b））局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导的个别基因导入受体，故称为局限性转导而普遍性而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性转导携带的宿主基因具有随机性•溶源转变溶源转变( (lysoneniclysonenic conversion) conversion)•当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新因整合到宿主的基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象性状的现象•当宿主丧失这一噬菌体时，通过溶源转变而获得的性状也同时当宿主丧失这一噬菌体时，通过溶源转变而获得的性状也同时消失。

溶源转变与转导有本质上的不同，首先是它的温和噬菌消失溶源转变与转导有本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带任何供体菌的基因；其次，这种噬菌体是完整的，而体不携带任何供体菌的基因；其次，这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的不是缺陷的•典型例子：典型例子： 不产毒素的白喉棒杆菌不产毒素的白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae) 菌株在被噬菌体感染而发生溶源化时，会变成产白喉毒素的致菌株在被噬菌体感染而发生溶源化时，会变成产白喉毒素的致病菌株低频转导与高频转导低频转导与高频转导•低频转导：低频转导：当用当用λ噬菌体转导发酵乳糖的基因时，噬菌体转导发酵乳糖的基因时，约约10-6 被感染的细菌中出现一个被感染的细菌中出现一个转导子转导子即大约10-6 噬菌体中只有一个带有发酵乳糖的基因噬菌体中只有一个带有发酵乳糖的基因•高频转导：高频转导：当当λ噬菌体整合到寄主细胞后，带有发噬菌体整合到寄主细胞后，带有发酵乳糖基因的酵乳糖基因的λ噬菌体也整合到寄主染色体上，成噬菌体也整合到寄主染色体上，成为双重溶源化细胞这种细菌用紫外线诱导时，为双重溶源化细胞。

这种细菌用紫外线诱导时，非转导的和转导的噬菌体同时脱离细胞染色体而非转导的和转导的噬菌体同时脱离细胞染色体而复制繁殖，两个噬菌体中就有一个带有发酵乳糖复制繁殖，两个噬菌体中就有一个带有发酵乳糖的基因用这种细胞释放的噬菌体转导发酵乳糖的基因用这种细胞释放的噬菌体转导发酵乳糖基因，就可以得到基因，就可以得到50％的转导子％的转导子 供体菌供体菌受体菌受体菌DNA片段片段转化：转化：指同源或异源的游离指同源或异源的游离DNA分子（质粒和染色体分子（质粒和染色体DNA））被被自然或人工感受态细胞提取，并得到表达的水平方向的基因转自然或人工感受态细胞提取，并得到表达的水平方向的基因转移过程这些被转化的游离的这些被转化的游离的DNA片段称为片段称为转化因子转化因子 转化转化后的受体菌，称为后的受体菌，称为转化子转化子 1928年，年，Griffith发现肺炎链球菌（发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae））                的转化现象的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力三、细菌的遗传转化（三、细菌的遗传转化（genetic transformationgenetic transformation）） 感受态细胞：感受态细胞：受体菌最容易接受外源受体菌最容易接受外源DNADNA片段并实现转化的片段并实现转化的 生理状态称为感受态。

生理状态称为感受态  转化需要转化需要二方面二方面必要条件：必要条件：1、建立了感受态的受体细胞、建立了感受态的受体细胞2、外源游离、外源游离DNA分子（转化因子）分子（转化因子）自然感受态自然感受态是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌 自身的基因控制；自身的基因控制；人工感受态人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNADNA 的能力，或人为地将的能力，或人为地将DNADNA导入细胞内导入细胞内转化因子通常是双链转化因子通常是双链DNA 转化过程转化过程: ①①感受态的出现感受态的出现 ② ②转化因子的吸附与掺入转化因子的吸附与掺入 ③ ③转化因子的整合转化因子的整合 噬菌体噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒转染转染(transfection)：：转染的特点：转染的特点：提纯的噬菌体提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。

进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒人工转化：人工转化：用用CaCl2处理细胞，处理细胞，电穿孔电穿孔等是常用的人工转化手段等是常用的人工转化手段        在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，段，不是由细菌自身的基因所控制，不是由细菌自身的基因所控制，是基因工程的奠基是基因工程的奠基石和基础技术石和基础技术        用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源可以摄取外源DNA的的“人工感受态人工感受态”电穿孔法电穿孔法（（electroporation):用用高压脉冲电流高压脉冲电流击破细胞膜形击破细胞膜形成小孔，使各种大分子（包括成小孔，使各种大分子（包括DNA)能通过这些小孔进入细胞，能通过这些小孔进入细胞，所以又称所以又称电转化电转化五五. . 原生质体融合原生质体融合将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内及属间）将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内及属间）原原生质体生质体融合成为一个新的重组子的技术融合成为一个新的重组子的技术原生质体融合步骤：原生质体融合步骤：1、原生质体制备、原生质体制备2、原生质体融合和再生、原生质体融合和再生3、融合子的选择、融合子的选择•微生物细胞融合的研究始于微生物细胞融合的研究始于19761976年。

年•主要过程：主要过程： 先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，再将形成的原溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂生质体离心聚集，并加入促融合剂PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )促促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子定它们是否是重组子 杂交杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式有性杂交有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并：指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式产生新遗传型后代的一种方式 （一）有性杂交（一）有性杂交第四节第四节  真核微生物的基因重组真核微生物的基因重组能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交（二）准性杂交（二）准性杂交准性生殖准性生殖是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。

它是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程它类似于有类似于有性生殖，但比之更原始的一种生殖方式，性生殖，但比之更原始的一种生殖方式，它可使同一生物的两个不同它可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组在半知菌类中最为常见在半知菌类中最为常见2、异核体形成、异核体形成1、菌丝联合、菌丝联合3、核配、核配4、体细胞交换和单倍体化、体细胞交换和单倍体化准性生殖的过程：准性生殖的过程： 杂合二倍体只有相对的稳定性，在其繁殖过程中虽不进行减杂合二倍体只有相对的稳定性，在其繁殖过程中虽不进行减数分裂，但在数分裂，但在有丝分裂有丝分裂中可以发生染色体交换和染色体单倍化，中可以发生染色体交换和染色体单倍化，从而形成各种分离子从而形成各种分离子 第五节第五节    基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种         基因突变：基因突变：一个基因内部遗传结构或一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何可序列的任何可                              遗传的改变遗传的改变野生型（原始性状）野生型（原始性状）基因突变基因突变突变型（新性状）突变型（新性状）一、基因突变的定义一、基因突变的定义自发突变：自发突变：在自然条件下发生的基因突变。

在自然条件下发生的基因突变诱发突变：诱发突变：利用物理化学因子处理微生物使其产生的突变利用物理化学因子处理微生物使其产生的突变 回复突变：回复突变：突变菌株发生突变，回复到出发菌株的状态突变菌株发生突变，回复到出发菌株的状态 基因基因突变突变分为分为 二、基因突变的类型二、基因突变的类型同义突变：同义突变：碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的变化碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的变化错义突变：错义突变：碱基序列的变化引起产物氨基酸的变化碱基序列的变化引起产物氨基酸的变化无义突变：无义突变：碱基的改变是密码子变为终止密码子碱基的改变是密码子变为终止密码子移码突变：移码突变：碱基的缺失或插入使翻译的阅读框发生改变，碱基的缺失或插入使翻译的阅读框发生改变，                    从而使氨基酸序列完全变化从而使氨基酸序列完全变化不同的碱基变化对遗传信息的改变不同：不同的碱基变化对遗传信息的改变不同：常见的微生物突变类型：常见的微生物突变类型：1、营养缺陷型（、营养缺陷型（auxotroph））特点：特点：在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长负选择标记负选择标记（突变株不能通过选择平板直接获得）（突变株不能通过选择平板直接获得）缺乏合成其生存所必需的营养物的突变型。

缺乏合成其生存所必需的营养物的突变型2、抗药性突变型（、抗药性突变型（resistant mutant)        由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性的突变型抗生素，产生抗性的突变型3、条件致死突变型、条件致死突变型(conditional lethal mutant)        在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型致死效应的突变型4、形态突变型、形态突变型(morphological mutant)指造成形态改变的突变型指造成形态改变的突变型5、其他突变型、其他突变型如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和产如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和产量以及对某种药物的依赖性突变型等量以及对某种药物的依赖性突变型等             1）自发性）自发性             2）不对应性）不对应性             3）稀有性）稀有性             4）规律性）规律性             三、基因突变的机制三、基因突变的机制             5）独立性）独立性             6）可诱变性）可诱变性             7）遗传性）遗传性             8）可逆性）可逆性1、、基因突变的特点：基因突变的特点： 基因突变的自发性和非对应性的证明基因突变的自发性和非对应性的证明一一种种观观点点认认为为，，突突变变的的原原因因和和突突变变的的性性状状间间是是相相对对应应的的，，并并认认为这就是为这就是““定向变异定向变异””、、““驯化驯化””。

另一种观点认为，基因突变是自发的另一种观点认为，基因突变是自发的如何证明基因突变的非对应性？三个经典实验变量实验、涂布实验、影印实验变量实验、涂布实验、影印实验1943年年S. E. Luria与与M. Dlbruck进行了进行了Fluctuation test1949年年H. B. Newcombe的的Respreding plated incubacion1952年年J. Lederberg夫妇用夫妇用Replica- plating结束了争论结束了争论证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！2、自发突变的机制、自发突变的机制主要的原因是：碱基主要的原因是：碱基互变异构体互变异构体的存在导致形成不同的存在导致形成不同                            的碱基配对的碱基配对腺嘌呤氨基式腺嘌呤氨基式    A－－T配对配对腺嘌呤亚氨基式腺嘌呤亚氨基式       A－－C配对配对结果：导致结果：导致AT              GC碱基置换碱基置换：碱基与碱基之间的交换导致突变的发生：碱基与碱基之间的交换导致突变的发生       转换转换：嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的碱基置换。

嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的碱基置换      颠换颠换：嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的碱基置换嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的碱基置换3、诱发突变的机制、诱发突变的机制  （（1）碱基的置换（转换、颠换））碱基的置换（转换、颠换）碱基对置换碱基对置换substitution转换转换transition颠换颠换transversion（（2）移码突变）移码突变frame-shift mutant ：添加或缺失核：添加或缺失核    苷酸，引起阅读错误苷酸，引起阅读错误（（3）染色体畸变）染色体畸变chromosomal aberration ：缺失、重：缺失、重复、插入、易位、倒位复、插入、易位、倒位A、、碱基类似物碱基类似物-------5-BU尿嘧啶引起碱基的转换尿嘧啶引起碱基的转换5－溴尿嘧啶－溴尿嘧啶（胸腺嘧啶结构类似物）（胸腺嘧啶结构类似物）4、诱变剂、诱变剂B、、插入染料插入染料C、、与与DNA碱基直接起化学反应的诱变剂碱基直接起化学反应的诱变剂亚硝酸引起亚硝酸引起DNA的碱基转换的碱基转换“生物化学统一性生物化学统一性”法则法则：人和细菌在人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的必然也会作用于人的DNA，，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果所有生物的所有生物的DNA在结构及特性上具有一致性在结构及特性上具有一致性让细菌代人受过！让细菌代人受过！Ames试验：试验：利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用美国加利福尼亚大学美国加利福尼亚大学Bruce Ames教授于教授于1966年发明年发明具体操作：具体操作：检测检测鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨组氨酸营养缺陷型菌株酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率的回复突变率回复突变回复突变：：突变体失去的野生型性状，可以通过第二突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变Ames试验试验Ames试验四、四、DNA损伤的修复损伤的修复1、光复活作用、光复活作用嘧啶二聚体嘧啶二聚体嘧嘧  啶啶 光解酶光解酶2、、切除修复切除修复3、重组修复、重组修复4、、SOS修复修复        DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应。

的一种应急反应错误倾向的错误倾向的SOS修复修复第七节第七节 微生物与基因工程微生物与基因工程了解微生物学在基因工程技术的建立与发展中了解微生物学在基因工程技术的建立与发展中的重要意义，了解并掌握基因工程的基本过程的重要意义，了解并掌握基因工程的基本过程和基本技术和基本技术1. 基因工程概述基因工程概述（微生物学与基因工程的关系）（微生物学与基因工程的关系）2. 微生物与基因工程工具酶微生物与基因工程工具酶（限制性内切酶的基本概念及其在基因操作技术中的最基本应用）（限制性内切酶的基本概念及其在基因操作技术中的最基本应用） 3. 微生物与克隆载体微生物与克隆载体（克隆载体的基本要求，了解目前有哪些克隆得到应用，它们各有什么特点（克隆载体的基本要求，了解目前有哪些克隆得到应用，它们各有什么特点和联系（异同点）重点掌握质粒和和联系（异同点）重点掌握质粒和λ噬菌体克隆载体）噬菌体克隆载体）4. 微生物作为克隆载体的宿主微生物作为克隆载体的宿主（为什么微生物通常能成为基因工程的重要宿主，最常用的有哪些？）（为什么微生物通常能成为基因工程的重要宿主，最常用的有哪些？）5. 基因工程的常用技术和方法基因工程的常用技术和方法（重点介绍（重点介绍PCR技术，原理与方法）技术，原理与方法）第七节第七节     微生物与基因工程微生物与基因工程一、基因工程一、基因工程基因工程：基因工程：在基因水平上，改造遗传物质，即将分离到的或在基因水平上，改造遗传物质，即将分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。

状克隆载体克隆载体（（cloning vector））负责将外源负责将外源DNA片段运送到细片段运送到细胞中进行复制与扩增胞中进行复制与扩增微生物学与基因工程的关系微生物学与基因工程的关系微生物学不仅为基因工程提供了理论基础，同时也提供了操微生物学不仅为基因工程提供了理论基础，同时也提供了操作技术基因工程概述基因工程概述基因工程基因工程gene engineering人人工工将将供供体体的的遗遗传传物物质质--DNA 在在离离体体条条件件下下用用适适当当的的工工具具酶酶进进行行切切割割，，把把它它与与载载体体(vector)的的 DNA 分分子子连连接接，，然然后后与与载载体体一一起起导导入入某某一一受受体体细细胞胞中中，，让让外外源源遗遗传传物物质质进进行行正正常常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术 过程过程①①基因分离：基因分离：②②体外重组：外源体外重组：外源DNADNA与载体连接与载体连接③③载体传递：导入受体，使外源载体传递：导入受体，使外源DNADNA在受体中表达在受体中表达④④复制、表达复制、表达⑤⑤筛筛选选、、繁繁殖殖：：对对重重组组后后的的大大量量重重组组子子性性状状进进行行筛筛选选，，从从中中选选出出所需性状重组子，并使之稳定繁殖。

所需性状重组子，并使之稳定繁殖获得目的基因获得目的基因选择基因载体选择基因载体体外重组体外重组外源基因导入外源基因导入（细菌（细菌、、植物植物、、动物动物、、基因枪基因枪））筛选和鉴定筛选和鉴定应用应用二、基因工程的基本操作二、基因工程的基本操作微生物在基因工程中的作用：微生物在基因工程中的作用： 1.1.微生物作为克隆载体微生物作为克隆载体: :质粒、病毒、噬菌体质粒、病毒、噬菌体 2.2.微生物生产基因工程工具酶；微生物生产基因工程工具酶； 1 1) )限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 2 2)DNA)DNA连接酶连接酶 3.3.微生物作为克隆载体的宿主微生物作为克隆载体的宿主 1 1) )原核生物宿主原核生物宿主 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 2 2) )真核生物宿主真核生物宿主 酿酒酵母酿酒酵母 4.4.微生物作为微生物作为基因产物的重要基因产物的重要表达载体表达载体 5. 5.理论基础理论基础(主要来自对微生物的研究主要来自对微生物的研究)    6. 微生物的多样性提供了丰富而独特的基因资源。

微生物的多样性提供了丰富而独特的基因资源2. 微生物与基因工程工具酶微生物与基因工程工具酶基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得中分离和纯化而获得限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）DNA聚合酶聚合酶碱性磷酸脂酶碱性磷酸脂酶核酸外切酶核酸外切酶单链核酸内切酶单链核酸内切酶其它工具酶：其它工具酶：指能识别双链指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割附近切割DNA的一类核酸内切酶的一类核酸内切酶 质粒载体质粒载体λ噬菌体载体噬菌体载体柯斯质粒载体柯斯质粒载体M13噬菌体载体噬菌体载体真核细胞的克隆载体真核细胞的克隆载体人工染色体人工染色体噬菌粒载体噬菌粒载体√√3. 微生物与克隆载体微生物与克隆载体常用的基因工程宿主常用的基因工程宿主1）大肠杆菌大肠杆菌3）酿酒酵母）酿酒酵母2）枯草芽孢杆菌）枯草芽孢杆菌特点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中特点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中            生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚4）动物细胞）动物细胞4. 微生物作为克隆载体的宿主微生物作为克隆载体的宿主DNADNA的体外扩增的体外扩增 穆利斯发明了聚合酶链式反应穆利斯发明了聚合酶链式反应（（polymerase chain reaction, PCR），），这是一种在体外这是一种在体外模拟细胞内进行的模拟细胞内进行的快速快速扩增特定扩增特定DNADNA序列的新技术。

序列的新技术PCRPCR扩增的条件：扩增的条件： DNADNA摸板摸板引物引物 脱氧核苷三（脱氧核苷三（dNTPdNTP））磷酸磷酸DNADNA聚合酶聚合酶扩增缓冲液扩增缓冲液 钙离子钙离子  基因工程的常用技术和方法基因工程的常用技术和方法PCR PCR 3 3个基本反应步骤：个基本反应步骤：1 1、变性（、变性（denaturationdenaturation））2 2、退火（、退火（annealingannealing））3 3、延伸（、延伸（extensionextension）） DNA的体外扩增的体外扩增引物（引物（primer）：）：与目的与目的DNA片段末端互补的寡核苷酸片段片段末端互补的寡核苷酸片段TaqDNA聚合酶：从水生栖热菌（从水生栖热菌（Thermus aquaticus)中分离得中分离得                               到的耐热的到的耐热的DNA聚合酶基本反应：基本反应： 1）变性）变性  加热，模板加热，模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条经热变性，双链被解开，成为两条 单单链链2）退火）退火  温度降低，寡核苷酸引物与模板温度降低，寡核苷酸引物与模板DNA配对配对3）延伸）延伸   在适宜条件下，引物在适宜条件下，引物3，端向前延伸，合成与模板互，端向前延伸，合成与模板互补的补的DNA链链性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。

否则生产或科研都无法正常进行影响微生物菌种稳定性的因素：影响微生物菌种稳定性的因素：                      a））变异；变异；b））污染；污染； c））死亡第八节第八节  菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复壮与保藏在掌握微生物遗传学相关知识在掌握微生物遗传学相关知识的基础上，了解微生物菌种保的基础上，了解微生物菌种保藏的方法和原理藏的方法和原理一、菌种的衰退与复壮一、菌种的衰退与复壮纯菌纯菌种种自发突变自发突变不纯菌不纯菌种种突变个体突变个体传代增殖传代增殖原始个体原始个体衰退菌衰退菌种种衰退衰退：菌种出现或表现出负变性状：菌种出现或表现出负变性状1））从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种得具有原有典型性状的菌种  2））有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选日常的菌种维护工作中不断筛选“正变正变”个体菌种的复壮：菌种的复壮：二、防止衰退的措施二、防止衰退的措施1））减少传代次数；减少传代次数；2）创造良好的培养条件；）创造良好的培养条件；3）利用孢子或者芽胞传代）利用孢子或者芽胞传代4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；5）采用有效的菌种保藏方法）采用有效的菌种保藏方法三、菌种保藏三、菌种保藏目的目的：：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，            以供研究、生产、交换之用以供研究、生产、交换之用1）斜面传代保藏：）斜面传代保藏：有些菌要定期传代，否则，容易死亡有些菌要定期传代，否则，容易死亡2）干燥法）干燥法               A．．沙土管法沙土管法  保鲜细菌芽胞可用此法保鲜细菌芽胞可用此法               B．．麸皮管法麸皮管法  保藏霉菌、放线菌孢子可用此方法保藏霉菌、放线菌孢子可用此方法               C．．干燥法干燥法 （（3）冷冻法）冷冻法       A 冷冻干燥法冷冻干燥法  适于保鲜多种微生物，特别是细菌适用于此适于保鲜多种微生物，特别是细菌适用于此 法保藏法保藏       B   液液N保鲜法（保鲜法（-196℃））  适于不生孢子的丝状真菌的保藏。

适于不生孢子的丝状真菌的保藏       C   -70℃低温保藏，低温保藏，需超低温冰箱需超低温冰箱   （（4））   悬液法悬液法 将微生物细胞悬浮在水、甘油、蔗糖液、葡萄将微生物细胞悬浮在水、甘油、蔗糖液、葡萄糖液、盐糖液、盐 水、磷酸缓冲液中，某些细菌、酵母用水、磷酸缓冲液中，某些细菌、酵母用此法可保藏几年至近十年此法可保藏几年至近十年。