【最新word论文】126例急性白血病异常免疫表型分析【临床医学专业论文】.doc

1126 例急性白血病异常免疫表型分析作者：贺景娟,李耀华,孙雪静,万岁桂,徐娟,苏力,田丁【摘要】 白血病细胞异常免疫表型是区别于正常造血细胞的重要特征之一，也是流式细胞术检测微小残留病的基础为了了解急性白血病的异常免疫表型特征，本研究采用四色流式细胞术 CD45/SSC 双参数散点图设门技术对 126 例急性白血病患者的异常免疫表型进行分析，并初步探讨其在微小残留病检测中的意义结果显示：约 76％的患者可以检测到明确的异常抗原表达，白血病异常免疫表型可分为以下四类：抗原跨系列表达、跨阶段表达、过度表达及缺失表达，其阳性率分别为 39％、46％、21％和 29％约 11％的患者仅发生了单一的表型异常，其余患者则可以检测到两类或更多的表型异常结论：在大多数急性白血病患者中可以检测到明确的白血病异常免疫表型，在此基础上应用多参数流式细胞仪可以有效检测微小残留病变 【关键词】 急性白血病Aberrant Immunophenotypes in 126 Patients with Acute LeukemiaAbstract The existence of leukemia aberrant immunophenotypes (LAIP) has been suggested to be a valuable tool for the detection of minimal residual disease (MRD), as they could distinguish leukemic cells from normal hematopoietic progenitors. This study was purposed to analyze the characteristics of LAIP in acute leukemia and further explore the proportion of different types of LAIP in acute leukemia patients. Flow cytometry (FCM) with four color and CD45/SSC gating were used to detect the antigen expression in samples of bone marrow from 126 patients with acute leukemia. The results showed that definite LAIP could be detected in about 76% patients. The LAIP could be divided into four groups as crosslineage antigen expression, asynchronous antigen expression, antigen overexpression and antigen lack expression. The percentages of these LAIPs were 39%, 46%, 21% and 29% respectively. About 11% out of analyzed cases showed the existance of only one aberrant phenotype while two or more of aberrant phenotypes could be detected in majority cases. It is concluded that the LAIP with four subgroups can be detected in the majority of patients with acute leukemia and immunophenotyping based on LAIP is applicable for the detection of MRD.Key words acute leukemia; leukemia aberrant immunophenotype; minimal residual disease2急性白血病是一种克隆性恶性增殖的血液系统疾病，恶性细胞抗原的表达具有很大的异质性。

异常表达的抗原不仅在初发的白血病细胞中可以检测到，而且在治疗后达到形态学完全缓解（CR）时，残存的白血病细胞仍保留其初发时的抗原异常表达［1］ 白血病细胞的克隆性增殖特征为临床白血病免疫分型诊断及微小残留病（MRD）检测提供了更准确依据白血病细胞上异常表达的抗原称为白血病异常免疫表型（leukemia aberrant immunophenotyping, LAIP）,LAIP 是白血病细胞与正常造血细胞相区别的重要特征之一，也是流式细胞术（flow cytometry, FCM）免疫分型诊断及MRD 检测的基础综合文献报道［2-6］ ，LAIP 主要包括以下 4 种类型：抗原跨系列表达、跨阶段表达、过度表达及缺失表达本研究采用四色流式细胞术及CD45/SSC 双参数散点图设门的方法对 126 例急性白血病患者进行了全面的异常免疫表型分析，以期对急性白血病的临床诊断及 MRD 的检测提供帮助材料和方法病例资料126 例急性白血病患者来源于宣武医院血液科 1999 年 11 月-2006 年 06 月期间的门诊或住院病人，其中男性 71 例，女性 55 例，中位年龄 46（14-89）岁。

所有患者都经骨髓形态学、细胞化学及流式细胞术免疫分型诊断FCM 分型中髓系、淋系列抗原确定标准参照 EGIL 评分［7］, 形态学诊断及分型标准参见《白血病的诊断及疗效标准》 ［8］ FAB 亚型诊断结果：M1/M2 78 例，M4/M5 17 例，M6/M7 5 例，BALL 17 例以及 TALL 9 例由于多数急性早幼粒细胞白血病（APL，AMLM3 ）异常免疫表型不明显［9］ ，因此未将 M3 纳入研究范围实验材料单克隆抗体 初发急性白血病患者 FCM 免疫分型检测所需抗体基本资料见表1流式细胞仪 FACSCalibur 型（Becton Dickinson 公司产品） ，功率为 15 MW，激光光源采用氩离子气体激光器，波长为 488 nm，进行 PE、FITC、PerCP等荧光素的检测，另配有小功率半导体激光器，波长为 635 nm，进行 APC 的检测结合两个物理参数，前向散射光（forward scatter，FSC）及侧向散射光（side scatter, SSC） ，可进行 4 色 6 参数的综合分析实验方法标本处理、单克隆抗体标记 骨髓液直接免疫荧光标记法。

采集初发急性白血病患者的骨髓液 3-5 ml，肝素抗凝，用 PBS，pH 值 7.2-7.4 稀释后调节细胞浓度至（2-5）×107/ml，室温下进行单克隆抗体标记，详见荧光抗体标记说明书每次检测各种荧光素均设定相应抗体的同型阴性对照初发患者免疫分型抗体组合 免疫分型抗体组合见表 2实验各管均加入3CD45PerCP 以进行 CD45/SSC 双参数散点图设门上机检测 每次细胞获取前先用 FACScomp 自动软件分析标准荧光微球（calibration beads）以校准仪器样本收集及结果分析均采用CellQuest（version3.2）软件进行由于白血病样本通常存在异常的散射光特征及较强的自发荧光，部分患者样本在数据获取前须进行条件设置优化：作FSC/SSC 二维散点图，调节 FSC 增益及 SSC 检测电压，使不同细胞群既能全部显示在散点图内，又可清楚区分，同时调节 FSC 阈值去除大部分碎片初诊患者每管收集 10 000 个细胞所有检测均采用 CD45/SSC 双参数散点图框定白血病细胞的位置（设门） ，再对门内细胞进行各种荧光抗体的分析设门内细胞大于相应阴性对照 20％确定为抗原阳性表达。

统计学分析采用 Epidata 7.0 软件两次输入数据并校准，应用 STATA 7.0 软件包进行统计学分析，本研究中数据假设检验均采用双侧检验，以 p<0.05 作为显著性检验的标准结 果126 例初发非 M3 患者免疫表型分析显示，96 例（76％）存在明确 LAIP，其中 14 例（11%）患者仅见单一的 LAIP 类型，其余患者均可见两类或更多的表型异常各类异常表型的分布与 FAB 亚型无明显相关抗原跨系列表达49 例（39％）患者存在明确的抗原跨系列表达，在伴淋系抗原表达的AML（Ly+ AML）病例中，CD7+ 24 例、CD19+ 11 例伴髓系抗原表达的ALL（My+ALL ）病例中，CD13+、CD33+和 CD117+的例数分别为 6、4 和 2 例在图 1 上一行的 AMLM2 患者的流式细胞图中可见髓系幼稚细胞群表达 CD33 同时又跨系列表达 CD7，而下一行的正常对照者图中无 CD33/CD7 共表达细胞群（图 1） Figure 1. Crosslineage antigen expression (CD7+ AMLM2).抗原跨阶段表达58 例（46％）患者可见抗原跨阶段表达,在 AML 病例以 CD34+CD11b+共表达和 CD34+CD56+共表达两种异常最多见，跨阶段异常在 ALL 较少见，仅 2 例见CD34+CD20+共阳性的异常表型。

在图 2 上一行为 AMLM1 患者的流式细胞图中可见幼稚髓系细胞群同时表达 CD34 和 CD11b，而下一行为健康对照者图中，无异常表达的细胞群（图 2） Figure 2. Asynchronous antigen expression (AMLM1). 抗原过度表达4异常27 例（21％）患者可见抗原过度表达异常，在 AML 病例以CD34、CD11b、CD56 及 CD117 的过度表达为主CD10 和 CD7 分别是 BALL 和TALL 中最常见的过度表达抗原在图 3 上一行 TALL 患者的流式细胞图中可见幼稚淋系细胞群过度表达 CD7，而下一行健康对照者图中则无（图 3） Figure 3. Antigen overexpression (TALL). 抗原的缺失表达异常37 例（29％）AML 患者可以检测到抗原的缺失表达异常，以 CD13、CD33及 HLADR 等抗原易见9 例（52.9％） BALL 患者可见的 CD45 表达缺失或明显减弱，1 例 TALL 患者呈 CD2 表达缺失图 4 的上一行为 AMLM2 患者流式细胞图中幼稚髓系细胞群 HLADR 表达缺失，而健康对照者图中可见 HLADR 表达（图 4） 。

讨 论Foon 等［10］于 1986 年首次在 Blood 杂志上报道了利用 FCM 免疫分型方法诊断白血病与淋巴瘤1997 年，Borowitz 等［11］首次拟定了利用 FCM 免疫分型法诊断白血病的诊断标准近年来，FCM 已由当时代表科技潮流的高精仪器变为现在血液系统恶性疾患诊治中不可缺少的检测工具本组 126 例初发非 M3 急性白血病患者免疫分型结果显示，约 76％的患者初发时存在异常免疫表型，AML 与 ALL 分别为 69％和 88％AML 异常表型的阳性率略高于 Macedo 等［12］的报道，可能与对某些异常表型确定标准的差异有关，例如，Macedo 等未将 CD117+CD15+的抗原组合列入异常表型范围，但我们的经验是，正常骨髓中 CD117+CD15+双阳性细胞的比例<0.01%，可以作为一种异常的免疫表型与正常造血细胞相区别早期报道关于 AMLLAIP 的数据明显较低，可能与对异常免疫表型的认识不足及标记的荧光抗体较少有关关于各类 LAIP 的报。