微生物作业指导书.doc

XHR/JCZL-02-011-2014某宏兴乳业某微生物检验作业指导书 受控状态：发放号：2014-02-28实施某宏兴乳业某发布2014-02-25发布 / 目 录目录·························································1§1菌落总数···················································2§2大肠菌群的测定·············································7§3沙门氏菌检验··············································10§4金黄色葡萄球菌检验········································15§5阪崎肠杆菌的检验··········································18宏兴乳业 菌落总数测定1.术语和定义 菌落总数 (aerobic plate count)食品检样经过处理，在一定条件下〔如培养基、培养温度和培养时间等〕培养后，所得每g〔mL〕检样中形成的微生物菌落总数。

2.设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃ 2.3 烘箱 2.4 天平：感量为 0.1 g 2.5 均质器 2.6 无菌吸管：1 mL〔具 0.01 mL 刻度〕、10 mL〔具 0.1 mL 刻度〕或微量移液器及吸头2.7 无菌锥形瓶：容量 250 mL、500 mL 2.8 无菌培养皿：直径 90 mm 2.9 菌落计数器2.10试管，18*180，20*200 3.培养基和试剂 3.1 平板计数琼脂培养基 3.2 无菌生理盐水，0.85% 4.检验程序 菌落总数的检验程序见下列图： ↓↓ ↓ ↓ 5.操作步骤 5.1.样品的稀释 5.1.1 固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有 225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。

5.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶〔瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠〕中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液5.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中〔注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面〕，振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液5.1.4 按以上操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液每递增稀释一次，换用 1 次1 mL 无菌吸管或吸头 5.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择 2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液〔液体样品可包括原液〕，在进展 10 倍递增稀释时，吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿同时，分别吸取 1 mL 空白稀释液参加两个无菌平皿内作空白对照 5.1.6 及时将 15 mL～20 mL 冷却至 46 ℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀 5.2 培养 5.2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ±1 ℃℃培养48 h±2 h。

5.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基外表弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂外表覆盖一薄层琼脂培养基〔约 4 mL〕，凝固后翻转平板，按 5.2.1 条件进展培养 5.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量菌落计数以菌落形成单位〔colony-forming units，CFU〕表示 5.3.1 选取菌落数在 30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数低于 30 CFU的平板记录具体菌落数，大于 300 CFU的可记录为多不可计每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数 5.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，那么不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；假设片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数 5.3.3 当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，那么将每条单链作为一个菌落计数6.结果与报告 6.1菌落总数的计算方法 6.1.1 假设只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数X围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g〔mL〕样品中菌落总数结果。

6.1.2 假设有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数X围内时，按公式〔1〕计算： N=(1)式中： N——样品中菌落数； ∑C——平板〔含适宜X围菌落数的平板〕菌落数之和； n1——第一稀释度〔低稀释倍数〕平板个数； n2——第二稀释度〔高稀释倍数〕平板个数； d——稀释因子〔第一稀释度〕 例如： 稀释度1:100〔第一稀释度〕1:1000〔第二稀释度〕菌落数〔CFU〕232，24433，35N==24727上述数据按7.2.2数字修约后，表示为25000或2.5×1046.1.3 假设所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU，那么对稀释度最高的平板进展计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算 6.1.4 假设所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU，那么应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算 6.1.5 假设所有稀释度〔包括液体样品原液〕平板均无菌落生长，那么以小于 1乘以最低稀释倍数计算 6.1.6 假设所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU之间， 其中一局部小于30 CFU或大于300 CFU时，那么以最接近 30 CFU或 300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

6.2 菌落总数的报告 6.2.1 菌落数小于 100 CFU时，按“四舍五入〞原那么修约，以整数报告 6.2.2 菌落数大于或等于 100 CFU时，第 3位数字采用“四舍五入〞原那么修约后，取前 2位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入〞原那么修约后，采用两位有效数字6.2.3 假设所有平板上为蔓延菌落而无法计数，那么报告菌落蔓延 6.2.4 假设空白对照上有菌落生长，那么此次检测结果无效 6.2.5 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告7.备注本方法参考国标GB4789.2-2010大肠菌群的测定〔平板计数法〕1.术语和定义 1.1大肠菌群 coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌 1.2 最可能数 most probable number，MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法 2.设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃ 2.3 烘箱 2.4 天平：感量 0.1 g。

2.5 均质器 2.6 无菌吸管：1 mL〔具 0.01 mL 刻度〕、10 mL〔具 0.1 mL 刻度〕或微量移液器及吸头2.7 无菌锥形瓶：容量 500 mL 2.8 无菌培养皿：直径 90 mm 2.9 菌落计数器 3.培养基和试剂 3.1 结晶紫中性红胆盐琼脂〔Violet Red Bile Agar，VRBA〕3.2 煌绿乳糖胆盐〔Brilliant Green Lactose Bile，BGLB〕肉汤3.3 无菌生理盐水,0.85%4.检验程序 大肠菌群平板计数法的检验程序见下列图: ↓36℃±1℃ ↓ 18-24h↓ 36℃±1℃↓24-48h5.操作步骤5.1样品的稀释 5.1.1 固体和半固体样品： 称取 25 g 样品,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。

5.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL生理盐水的无菌锥形瓶〔瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠〕中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液 5.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL生理盐水的无菌试管中〔注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面〕，振摇试管或换用 1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液 5.1.4 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液每递增稀释1 次，换用1支 1 mL 无菌吸管或吸头从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min5.2 平板计数 5.2.1选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL同时取1 mL生理盐水参加无菌平皿作空白对照5.2.2 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂〔VRBA〕约倾注于每个平皿中小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

5.3 平板菌落数的选择 选取菌落数在 15 CFU～150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。