内质网应激蛋白ATF4调控STAT3信号通路促进黑色素瘤细胞生长及转移的研究.docx

    内质网应激蛋白ATF4调控STAT3信号通路促进黑色素瘤细胞生长及转移的研究    张学军 亓发芝[Summary]目的：探索内质网应激蛋白ATF4在黑色素瘤发生发展中的作用和机制方法：运用荧光定量PCR技术分析对比黑色素瘤细胞系和黑色素细胞系内ATF4表达的差异，运用CCK-8染色以及BrdU染色检测细胞生长及增殖能力，运用Tranwell技术检测细胞转移能力，运用免疫印迹技术检测细胞内STAT3磷酸化水平结果：ATF4 mRNA在黑色素瘤细胞中的表达水平显著高于黑色素细胞，显示肿瘤细胞中含有更高水平的ATF4 mRNA；在A375细胞中过表达ATF4后，细胞生长增殖速率提高，转移能力增强，而降低内源ATF4后，MM200细胞的增殖速度和转移能力都出现明显降低同时，A375细胞内ATF4含量的增加也引起了细胞内STAT3磷酸化水平以及细胞内IL-6表达的显著升高结论：内质网应激蛋白ATF4在黑色素瘤的发生发展中具有重要的调控作用，细胞内ATF4可能是参与调控了IL-6-STAT3信号通路，从而促进黑色素瘤细胞增殖和迁移[关键字]黑色素瘤；内质网应激；ATF4；肿瘤细胞增殖；肿瘤细胞侵袭；STAT3[]R739.5 [文献标志码]A []1008-6455（2018）07-0083-04Abstract： Objective To explore the role of endoplasmic reticulum （ER） stress protein ATF4 in cell proliferation and metastasis of melanoma. Methods RT-qPCR was applied to investigate the levels of mRNA expression. CCK-8 staining and BrdU staining were introduced to determine the abilities of cell growth and proliferation. Transwell system was used to detect the metastasis ability of cells. Immunoblotting was conducted to determine the protein levels in cells. Results The levels of ATF4 mRNA significantly increased in melanoma cell lines when compared to melanocytes. Ectopic expression of ATF4 efficiently enhanced the proliferation and metastasis of A375 cells. Abrogation of ATF4 in MM200 impaired cell growth and metastasis. Furthermore， ATF4 overexpression upregulated the expression of IL-6 and subsequently activated STAT3 signaling. Conclusion In general， our results revealed that ATF4 regulated cell proliferation and metastasis via activating IL-6-STAT3 signaling in melanoma.Key words： melanoma； endoplasmic reticulum stress； ATF4； tumor cell proliferation； tumor cell invasion； STAT3黑色素瘤，通常又稱恶性黑色素瘤（malignant melanoma），是一种常见的恶性皮肤肿瘤，生长迅速。

由于血管生成相对缓慢而容易造成营养和能量的供给不足，高速生长时期的黑色素瘤细胞内可能会发生多种应激状态，为应对这些生存环境的不利局面，细胞需要合成大量的蛋白（特别是分泌蛋白）去缓解外界生存环境的困局，而短时间内大量蛋白的合成给内质网（Endoplasmic reticulum， ER）带来了翻译和修饰的压力，会造成内质网内出现大量未折叠蛋白或者错误折叠蛋白的积累，从而产生内质网应激（ER stress）[1]，内质网应激会激活细胞内未折叠蛋白信号通路（The unfolded protein response pathway， UPR pathway）[2-4]近年来，越来越多的研究报道揭示了在肿瘤的发病过程中，UPR信号通路的关键作用[5-6]在多种肿瘤的生长以及转移过程中，PERK-eIF2-ATF4信号突进都扮演着重要角色肿瘤细胞中PERK-eIF2通路得不到有效激活，ATF4蛋白产生量过少时，肿瘤细胞在体外和体内的生长都会受到抑制[7-9]；在肿瘤细胞中敲除或者降低内源ATF4细胞的表达，可以有效抑制移植肿瘤的生长[7]，更有意思的是，如果在肿瘤细胞内过表达ATF4，细胞对多种抗肿瘤药物（如Cisplatin， Doxorubicin， Vincristine以及Etoposide）的抗性明显加强，体现了ATF4在肿瘤药物抗性中的重要作用[10-12]。

此外，该信号通路在肿瘤细胞转移方面也有着重要功能，在乳腺癌中敲除PERK后，肿瘤细胞的转移能力明显受到抑制[9]，而ATF4作为PERK下游重要分子，在肿瘤的转移以及EMT中也起到非常关键的调控作用[13-14]包括PERK-eIF2-ATF4通路在内的UPR信号通路在黑色素瘤中也扮演着重要角色，抑制细胞内PERK蛋白的活性，可以有效降低黑色素瘤的转移[15]，但是具体的分子机制仍不清楚黑色素瘤细胞不同于正常皮肤细胞一个主要特点是：细胞快速生长需要有大量的新蛋白产生，从而可在细胞中引起内质网应激，激活UPR信号通路[1，16-17]因此对内质网应激蛋白ATF4在黑色素瘤中的功能和分子机制的充分研究有助于黑色素瘤的临床治疗以及药物开发本研究关注ATF4蛋白在黑色素瘤细胞增殖和迁移中的作用，初步探讨ATF4调控黑色素瘤细胞增殖和迁移的分子机制1 材料和方法1.1 细胞培养：黑色素细胞系（HEMn-MP和HEMn-DP）和黑色素瘤细胞系（Mel-CV， MM200， A2058， A375和SKMel-28）均购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞库所有细胞系均使用含10%胎牛血清（FBS，购自于Gibico公司）的DMEM高糖培养基（购自于Corning公司）培养，培养条件为37℃，5% CO2。

1.2 荧光定量PCR：荧光定量PCR检测方法Reference[18]细胞在经过相应培养或处理后，使用TRIZol（购自Invitrogene公司）固定细胞并按照产品说明提取细胞内总RNA，然后使用Takara公司RNA逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA获得的cDNA使用Power SyberGreen Mix试剂盒（购自ABI公司）进行荧光定量PCR检测，检测机器为ABI公司生产7900荧光定量PCR仪1.3 免疫印迹：免疫印迹技术检测细胞中蛋白表达水平，具体方法Reference[19]细胞在经过相应培养或处理后，使用RIPA固定并裂解细胞，细胞内蛋白制成样品通过SDS-PAGE按蛋白相对分子量分离并转移到醋酸纤维素薄膜上，薄膜使用10%脱脂牛奶封闭后，按照需要分别孵育相应蛋白的一抗（Primary antibody），在4℃孵育过夜，然后使用辣根过氧化物酶交联的相应二抗（Secondary antibody）室温孵育1h，最后使用免疫印迹显色试剂盒（购自Thermo Fisherie Scientific公司）显色1.4 CCK-8和BrdU染色检测细胞增殖：Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒购自Dajino公司，按照产品说明书检测细胞增殖。

在96孔板中接种相应细胞，每孔接种细胞数为1×103个，共分成6组，培养时间分别为4、24、48、72、96或120h，然后向相应组中加入CCK-8试剂，培养箱中继续孵育2h，最后使用酶标仪读取450nm的吸光度，以该吸光值为基础计算成细胞数目BrdU细胞增殖检测试剂盒购自Cell Signaling Technology，按照产品使用说明书检测细胞增殖情况1.5 荧光素酶报告实验：本研究中使用荧光素酶报告基因实验检测ATF4对IL-6表达的调控作用，具体方法Reference[19]将包含人源IL-6的启动子的序列（2000bp）克隆到pGL3 basic质粒上，然后将该质粒与其它相应质粒共转染到HEK293T细胞中，细胞裂解液使用Dual-luciferase Assay Kit（购自Promega公司），按照产品说明书检测细胞中荧光素酶活性水平1.6 统计学分析：本研究所得结果，使用GraphPad 5.0软件进行统计学分析和处理所有实验均进行3次以上，所有数据以（x?±s）表示，两组数据比较采用Two-tailed Students t-test方法，两组以上数据采用单因素方差分析（One-way ANOVA）或双因素方差分析（Two-way ANOVA），P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果2.1 ATF4 mRNA水平检测结果：黑色素瘤细胞系Mel-CV、MM200、A2058、A375以及SKMel-28细胞中的ATF4 mRNA水平显著高于正常黑色素细胞系HEMn-MP，差异有统计学意义（P<0.05），说明在这些肿瘤细胞中，ATF4 mRNA含量相对较高，ATF4活性升高，可能与黑色素细胞病變为肿瘤细胞密切相关，并有可能参与调控了肿瘤细胞包括增殖和转移等特性相关2.2 黑色素瘤A375细胞ATF4转染结果：转染可高表达人源ATF4的质粒，提高了该细胞中ATF4的表达水平（见图2A）CCK-8检测结果显示，A375细胞内ATF4含量增加后，细胞的生长速率显著提高（见图2B）；BrdU检测结果显示ATF4过表达促进了A375细胞增殖（见图2C）实验结果说明，ATF4表达水平的提高可以促进黑色素瘤细胞生长及增殖；Transwell技术检测细胞转移能力，结果显示ATF4水平提高可以显著增加穿过小室薄膜的A375细胞数量，说明过表达ATF4可以增加黑色素瘤A375细胞的转移能力，ATF4具有促进黑色素瘤细胞转移的功能（见图2D～E）2.3 黑色素瘤MM200细胞si-ATF4转染结果：si-ATF4转染黑色素瘤MM200细胞，特异性降低该细胞中内源ATF4的表达水平（见图3A）。

CCK-8检测结果显示，MM200细胞在ATF4降低后，细胞生长的速率明显降低（见图3B）； BrdU检测结果显示转染si-ATF4的细胞增殖能力减弱（见图3C）；Tanswell实验结果显示，随着ATF4含量的降低，穿过小室薄膜的肿瘤细胞的数量显著减少（见图3D～E），说明降低细胞内ATF4水平可以抑制MM200细胞迁移能力2.4 黑色素瘤A375细胞中IL-6表达水平检测结果：结果显示过表达ATF4后，A375细胞中IL-6 表达水平显著升高（见图4A），进一步研究发现，ATF4过表达的A375细胞内STAT3蛋白磷酸化水平显著升高（见图4B），说明增加细胞内ATF4可以促进STAT3信号通路的激活利用IL-6受体（IL-6 receptor，IL-6R）抑制剂Sarilumab特异性阻断IL-6与IL-6R的结合，结果显示Sarilumab可以有效抑制ATF4过表达引起的ST。