视觉细胞的超微结构及传导与视觉、躯体感觉刺激相关的皮层激活fMRI实验研究.pdf

浙江人学博士论文缩略语表．．1 ，l —d i o c t a d e c y l 一3 ，3 ，3 ，3 ’一t e t r a m e t h y l i n d o —u 11c a r b o c y a n i n ep e r c h l o r a t e ，D il C l 8 ( 3 )应用于荧光追踪 的羰花青染料f M R If u n c t i o n a lm a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g i n g功能磁共振成像T E Mt r a n s m is s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yS E Ms c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y透射电子显微镜扫描电子显微镜E D T Ae t h y l e n ed i a m i n et e t r a —a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸C N Sc e n t r a ln e r v o u ss y s t e mT 1 W IT 1 一w e i g h t e di m a g i n gN O Sn i t r i Co x i d es y n t h a s eT U N E L ：。

e r m i a j ：u c ，o P x 7 n u i i o y a l t r 8 8 一中枢神经系统T l 加权成像一氧化氮合酶术端脱氧核苷酸转移 酶( T d T ) O r 导的d - U T P 缺口末端标记技术浙江人学博士论文视觉细胞的超微结构及传导与视觉、躯体感觉相关的皮层激活f M R I 实验研究浙江大学医学院细胞生物学2 0 0 2 级博士研究生方马荣导师李继承教授姚大卫教授摘要有关辐鳍亚纲的鱼、硬骨鱼及其他高等脊椎动物之问差异的研究，在进化上有着十分重要的意义鲟鱼是一古老的鱼种，作为～种活化石，由于其本身的经济价值，吸引了研究者较多的兴趣有关鲟鱼的视网膜感光细胞的研究资料缺乏，本文采用扫描和透射电子显微镜技术观察鲟鱼视网膜的视觉细胞超微结构，D i I 荧光染料单侧眼示踪后结合激光扫描共聚焦显微镜观察鲟鱼视觉传导路有关鱼类的视杆细胞已有较多的研究资料，但有关鱼类视网膜中的视锥细胞类型的研究报道很少孪生视锥细胞和双视锥细胞在形态学上存在差异，可能暗示它们在功能上存在差异我们挑选了三个亚群( 辐鳍亚纲的鱼、软骨鱼和硬骨鱼) 鱼的视网膜作了比较研究旨在证实是否多数鱼类存在孪生视锥细胞或双视锥细胞，或两种同时存在。

与陆地的脊椎动物相比，鱼类在水中频繁经历缺氧，它们能通过一些途径来抵消此类环境的变化缺血和缺氧对鲤鱼脑的作用已有较多研究，但未见鲟鱼有关这方面的报道本研究旨在探索缺氧对鲟鱼这种古鱼的中枢神经细胞凋亡方面的作用2浙江大学博十论文有关哺乳动物视觉中枢的出生后发育缺乏研究资料在哺乳动物如猪的眼球中，出生后早期视网膜就已发育成熟为了解视觉系统功能的早期发育改变，研究视觉皮层功能的出生后变化情况十分必要本研究采用功能磁共振成像( f M R I ) 技术观察小种猪生后6 个月内的视觉皮层功能激活变化，阐述其出生后视觉中枢的功能发育变化由于猪脑同人脑的结构相似性，且与人类中枢神经的发育过程也相类似，已成为一种十分有用的神经科学研究动物模型同时，由于猪性情温顺、猪脑的大小适宜，对猪脑作M R I 检查相对方便容易迄今为止，缺乏猪脑发育过程中刺激相关的f M R I 大脑皮层激活变化的系统数据，也未见联合猪脑功能活动检查与形态发育成熟参数检测的资料报道有关猪脑组织发生的文献极少，未见有关猪脑新皮层G A B A 能神经元发育成熟相关的文献本文观察6 月龄前小种猪在清醒状态下的后肢体疼痛与被动运动刺激诱发的脑功能激活变化，并分析与猪脑神经元和神经纤维内突触重塑相关蛋白如突触素和抑制性神经递质如G A B A发育变化之间的可能联系。

第一部分鲟鱼视觉细胞和视觉传导的复杂性目的：观察鲟鱼视觉细胞的超微结构和视觉传导特点方法：扫描和透射电子显微镜观察鲟鱼视网膜的视觉细胞，单眼D i I 荧光染料示踪后使用激光扫描共聚焦显微镜观察鲟鱼视觉传导路的特点结果：( 1 ) 与其他脊椎动物类似，鲟鱼视觉细胞也分为视杆细胞和视锥细胞视锥细胞明显比视杆细胞短，多数高度只有视杆细胞高度的一半视网膜中央区域、近中央区区域和周边区域的视杆细胞和视锥细胞比例相应为：0 ．4 5 ±0 ．0 4 、0 ．5 1 ±0 ．0 5 、0 ．6 3 4 - 0 ．0 3 ，方差分析的统计结果显示，视网膜周边区和中央区、视网膜周边区和近中央区的视杆细胞和视锥细胞比例差别具有统计学意义( P ( O ．0 5 ) 2 ) 观察到几种不同类型的视锥细胞，包括两种单视锥细胞，一种象烧瓶一样，相对较大的，另一种较长并指向外段；一种类型的双视锥细胞，由2 个不相同的视锥细胞部分紧密粘附在一起，其中～个具有较长的外节，另外一个外节较短：一种类型的孪浙江人学博士论文生视锥细胞，数目较稀少，由2 个同样的视锥细胞部分粘附在一起，外节的长度和形态相似随机统计视网膜中央区域的5 0 0 个视锥细胞中，双视锥细胞占2 7 ％，孪生视锥细胞占1 8 ％。

鲟鱼视网膜的孪生视锥细胞的外节有时与视杆细胞很相似透射电镜显示大约1 ／3 视锥细胞内节含有糖原，而在所有视锥细胞内节含有脂滴 3 ) 左眼视觉通路的D i I 荧光示踪在端脑腹外侧后部显示了一些斑点状的荧光标记；双侧的边缘视束显示强荧光标记，尤以右侧的边缘视束更强：边缘视束可被划分成背倒、腹侧视束及主要从腹侧视束发起的中间视束；双侧的投射纤维终止见于以下核团：丘脑中间核、丘脑前核和腹侧副核的前部，以及顶盖前核、顶盖前核的室周腹侧部和视前核在对侧( 即右侧) 的背侧副核、中央后核、顶盖前核的室周腹侧部和室周背侧部都观察到荧光标记，而顶盖前核浅部出现同侧标记还观察到一些荧光标记的纤维经后连合或轴位视束交叉到对侧，而中间视束终止在中间丘脑、前丘脑核，顶盖前核的室周腹侧部和顶盖前核的室周背侧部双侧的缰复合体也观察到荧光标记，尤以对侧的缓复合体荧光标记较强总体上，对侧半脑内的荧光标记显著较强腹侧副核的主要部分是双侧染色，而皮质核和球前复合体仅在对侧轻微标记双侧腹侧视束分开后终止在视顶盖的中央区和T l 束区，而背侧视束主要终止在视顶盖的表浅区中的T l 束区和T 2 束区；甚至在视顶盖较尾侧的区域，见双侧荧光标记，但以注射D iI 眼睛的对侧面较强。

结论鲟鱼视网膜存在多种类型的视觉细胞，鲟鱼视觉传导的复杂性接近高等脊椎动物，提示了鲟鱼在进化上的重要性第二部分鱼类的孪生视锥细胞和双视锥细胞目的：旨在证实是否多数的鱼类存在孪生视锥细胞和双视锥细胞或两种同时存在方法：扫描电镜观察三种亚群( 辐鳍亚纲的鱼，软骨鱼和硬骨鱼) 鱼的视网膜结果：所观察的鱼类视网膜有四种类型的视觉细胞鲟鱼视网膜中央区域可见单个视锥细胞和视杆细胞，它们在结构上相当短在软骨鱼( 鲨鱼)视网膜中，与鲟鱼相同区域的视觉细胞非常高，并有许多双视锥细胞双视锥细胞是两种不完全相同的视锥细胞粘附在一起构成然而，雀鳝中的双视锥细4浙江大学博士论文胞仅在内节的最内侧区相互粘附在一起，外节部分相互分丌在硬骨鱼视网膜中，单个视锥细胞常常变得更加突出，孪生视锥细胞( 即由两个完全相同的视锥细胞共同粘附组成) 很容易识别，双视锥细胞也能观察到甚至在陆地上度过很长时间的弹涂鱼中，孪生视锥细胞和双视锥细胞也明显存在，尽管这些细胞尺寸很小在辐鳍亚纲的鱼( 鲟鱼和雀鳝) 和软骨鱼( 鲨鱼) 的中央区，双视锥细胞比孪生视锥细胞要多在实验所选用的硬骨鱼中，孪生视锥细胞和双视锥细胞都很容易观察到，且数量较多。

结论：在实验选用的所有鱼种中，即辐鳍亚纲鱼、软骨鱼和硬骨鱼的视网膜中存在孪生视锥细胞和双视锥细胞，首次揭示不同种群的鱼类视网膜中，这些视锥细胞的形态复杂性和对鱼视网膜功能多样性的总体影响第三部分缺氧诱导的鲟鱼中枢神经系统差异性凋亡模式目的：探索缺氧对鲟鱼的中枢神经系统( C N S ) 凋亡方面的影响方法：通过将鲟鱼暴露于空气中或簧于低氧分压水中造成缺氧，经6 h 或3 0 h 恢复后处死鲟鱼，对C N S 的下列区域如视网膜、嗅叶、视顶盖、垂体、小脑、脑桥、延髓和脊髓作T U N E L 染色，观察细胞凋亡，并用免疫印迹法检测活化的c a s p a s e - 3表达血气分析仪检测了血氧分压结果：( 1 ) 对照组血氧张力为9 ．1k i l o -P a s c a l ( k P a ) ：鲟鱼暴露于空气3 0 m i n 和移入低氧压水中3 0 m i n 后，其血氧压力分别为2 ．0 和3 ．1k P a 2 ) 对照组的C N S 各部位仅见少量凋亡细胞，4 0 0 X放大时每个视野少于0 ．1 个凋亡细胞 3 ) 与对照组的视网膜相比，各缺氧组凋亡细胞数目明显增加( p < O ．0 5 ) 。

4 ) 观察到组2 ( 经暴露空气中半小时，6小时恢复后) 中的鲟鱼外核层、内核层及神经节细胞层，尤其是内核层凋亡细胞显著增加，每个视野视网膜各层凋亡细胞数目相应是1 4 ．O ±4 ．0 ，5 7 ．0 + - 1 2 ．0和4 ．9 ±l ’0 5 ) 组3 ( 经暴露空气中半小时，恢复3 0h ) 视网膜各层凋亡细胞数目很少，但分布方式类似，内核层凋亡细J 1 6 l 最多，每个视野3 ．9 + - - 0 ．6 0 6 ) 组4 和组5 中( 鱼被移入低氧分压鱼缸3 0 r a i n ，放回原来含氧丰富的鱼缸罩恢复6 h 或3 0h ) ，凋亡细胞数目类似，节细胞层较多；( 7 ) 组4 和组5 中5浙江大学博士论文鱼移入低氧分压鱼缸缺氧3 0 m i n ，视网膜出现凋亡细胞，比组2 和组3 中鱼置于空气中缺氧3 0 m i n 明显减少 8 ) 在嗅叶，组2 和组3 每个视野凋亡细胞数仅增加1 个左右组4 、组5 中每个视野凋亡细胞数与对照组相比未见增加 9 )在视顶盖区，组2 中每个视野凋亡细胞数1 7 ．9 ±3 ．5 ，但组3 中每个视野凋亡细胞数减少到1 3 ．3 ±0 ．5 ：组4 、组5 中，每个视野凋亡细胞数仅在组5 中增加到1 8 ．8 ±0 ．6 ，这与组3 相比有显著统计学意义( p < O ．0 5 ) 。

1 0 ) 组2 和组3 中，缺氧后脑下垂体凋亡细胞明显增加，每个视野凋亡细胞数目分别为1 8 ．1 ±4 ．2和1 5 ．3 ±0 ．3 ；组4 和组5 中，每个视野凋亡细胞数目仅在组5 中增加到4 ．1±0 ．3 2 ：垂体中凋亡细胞变化形式类似于视顶盖 1 1 ) 在小脑中，与对照组相比，组3 和组5 中，缺氧后凋亡细胞增加( p < O ．0 5 ) 1 2 ) 在脑干( 脑桥和延髓) 中，与对照组相比，缺氧后凋亡细胞增加，具有统计学意义，类似于小脑中变化：经3 0 h 恢复后，缺氧后凋亡细胞增加，具有统计学意义( p < O ．0 5 ) 1 3 ) 在脊髓，鱼冒于空气中缺氧3 0m i n ( 组2 和组3 ) 或移入低氧分压鱼缸缺氧3 0m i n ( 组4 和组5 ) 后观察到大量的凋亡细胞，这些凋亡细胞主要集中于脊髓背侧角和腹侧角区及中央管周围，凋亡细胞绝大多数为小细胞；组2 和组3 脊髓中每个视野凋亡细胞数目约为2 0 ，多于组4 和组5 中每个视野凋亡细胞数目( 约为1 0 或略少于1 0 ) 1 4 ) 蛋白印迹实验证实了缺氧后在鱼中存在活化的c a s p a s e3 ，鲟鱼于空气中暴露缺氧3 0m i n 后，出现很强的脊髓c a s 。