第九章基因工程药物.ppt

1.无性繁殖系的组建2.基因工程药物的消费3.基因工程药物的检验基因工程药物：将生物体内生理活性物质的基因，利用重组DNA技术加以改造，然后使其在细菌、酵母、动物细胞中大量表达的新型药物第九章基因工程药物1.无性繁殖系的组建1.1 人胰岛素工程菌的组建1.2 人2b型干扰素工程菌的组建1.3 集落刺激因子工程菌的组建(1)胰岛素的构造及其生物合成1.1人胰岛素工程菌的组建(2)人胰岛素的消费方法:A. 化学合成法制人胰岛素 根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成技术可行，但其消费本钱奇高B. 化学转型法制人胰岛素 猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，可将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素但工艺复杂，产品的价格不菲C. 基因工程法制人胰岛素 1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌消费人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别a. A链和B链分别表达法：由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%20%,采用这条工艺道路消费的重组人胰岛素每克本钱高达100美元以上。

b.人胰岛素A链和B链同时表达法：c.人胰岛素原表达法：由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应进步，折叠率高达80%以上，每克最终产品的本钱仅50美元1.2 人2b型干扰素工程菌的组建(1)人2b型干扰素基因的获得：应用PCR的方法，从人的染色体片段获得2)重组表达质粒的特点：具有双SD序列抗病毒活性高构建过程见书P172图9-21.3 集落刺激因子工程菌的组建(1)RT-PCR法制备GM-CSF cDNA从正常人血中别离出单核细胞，提取总RNA；引物设计：引物：5端增加有EcoR酶切位点，起始密码子，个组氨酸密码子和凝血酶切位点引物：5端加一个终止密码子和一个BamH酶切位点PCR扩增产物和质粒pBV220双酶切后,重组连接，挑选氨苄青酶素抗性转化子，经酶切挑选、鉴定，阳性重组子命名为pGM09(2)GM-CSF重组表达载体的构建(1)rhG-CSF基因工程菌的培养与发酵1)发酵用工程菌种的挑选将保存的菌种接种到LB琼脂平板上，过夜培养挑取单菌落进展液体培养，取少量经热诱导培养后，用SDS-PAGE分析选取表达量最高的克隆作为发酵用种子2)发酵培养基的选用将工程菌接种于种发酵培养基中进展发酵，比较诱导表达结果及收菌量，选取适宜的发酵用培养基2.基因工程药物的消费2.1 基因工程菌的培养与发酵3)接种量对发酵的影响以10或15接种量较适宜4)溶解氧程度对发酵的影响5)pH对工程菌生长和表达的影响前期培养着重工程菌的生长：pH6.8-7.4后期培养着重外源蛋白的表达：pH6.0-6.56)热诱导对表达量的影响 热诱导表达的工程菌一般在菌体的对数生长期或对数生长后期，在2min内温度突然升高10 以上。

7)高密度对表达量的影响高表达的前提下，适当进步菌体密度高程度溶解氧(40)有利于外源蛋白的形成.(2)IFN-2b基因工程菌的培养与发酵工程菌株:SW-IFN2b/DH5工程菌的种子培养:将工程菌接种在LB培养基中， 30振摇培养10h.工程菌的发酵:接入种子培养液至发酵罐中，30发酵h，然后在42诱导h完成发酵2.2 基因工程药物的别离纯化(1)影响别离纯化的主要因素产物活性、纯度和杂质产物表达形式和表达程度产物本身的分子特性产物的用处和需求量(2)各种表达形式的别离纯化方法包涵体的别离纯化方法A. 菌体细胞的搜集与破碎： 采用物理、化学和酶学三种方法进展破碎B. 包涵体的别离、洗涤与溶解： 通过离心别离；TE缓冲液反复洗涤； 用尿素、盐酸胍、SDS等溶解.C. 变性蛋白质的纯化： 采用的方法有凝胶过滤、离子交换层析和 高效液相色谱等D. 重组蛋白质的复性： 适当条件使其重新折叠例：rGM-CSF的别离纯化3.1 基因工程药物的质量控制(1)与传统药品消费的区别 利用活细胞作为表达系统，产品为蛋白质，具有复杂的分子构造 产品的制备过程中，药物容易发生变化 参与人体的生理调节作用，极微量就可产生显著效应，在性质或剂量上不能有任何偏向 因此，必需要严格控制药品质量，确保产品平安有效。

3.基因工程药物的检验(2)基因工程药物的特点分泌量极低而生理药理活性极高具有细胞和组织特异性多数细胞因子具有多功能性细胞因子间存在复杂的互相作用具有低免疫原性(3)基因工程药物的质量要求A.提供表达体系及工程菌的详细资料B.提供培养方法，纯化方法、除去微量杂质的 方法等C.要求进展理化鉴定，包括产品的特征、纯度 及与天然产品的一致性D.要求进展外源核酸和抗原检测E.与天然产品进展生物活性或效力试验的比较F.进展动物毒性试验G.要有足够的对人体的平安性资料H.必须经过临床试验，以评价其平安性和有效性 (4)基因工程药物的质控要点1)原材料的控制：表达载体和宿主细胞克隆基因的序列2)消费的控制：原始细胞库有限代次的消费连续培养消费别离纯化(5)终产品的质量控制方法：电泳法、免疫学分析法、受体结合试验 和高效液相色谱法等内容：氨基酸成分分析、肽图分析、蛋白质 浓度及分子量测定、蛋白质二硫键分析1)产品的鉴定：2)纯度分析：目的蛋白质的含量测定产物杂质检测宿主细胞蛋白、病素和细菌等微生物、热原质、内毒素、致敏原及DNA等3)生物活性测定：4)平安性评价：5)稳定性考察：6)产品一致性的保证：体内生物活性测定：根据目的基因产物的 生物学特性，建立适宜的生物学模型体外生物活性测定：细胞培养计数法等除一般平安性要求外，还要根据基因工程产品本身的构造特性，进展某些药物动力学和毒理学研究。

对纯度、分子特征和生物学效价等多方面进展综合评价(6)基因工程药物的制造及检定规定符合?中国生物制品规程?的各项规定2)制造：3)检定1)定义、组成及用处A.根本要求：设施、原料、消费用水、消费用具B.工程菌菌种的要求：菌种的名称；种子批建立、传代及保存；菌种鉴定；C.原液的制备及检定：种子液及发酵液的制备及条件；发酵液的处理；初步纯化及高度纯化D.半成品配制、分批：先稀释除菌，再分批E.另对分装、冻干、规格、包装等均进展了规定3.2基因工程药物常用的检验方法(1)化学检定法Lowry法、电泳法、高效液相色谱法等(2)肽图分析法每一种蛋白质的肽图谱具有特异性、专一性银染SDS-PAGE微量肽图法：CNBr裂解较大肽片段RP-HPLC法：胰蛋白酶裂解有肽段(3)外源DNA残留量的测定杂交分析(4)宿主细胞蛋白杂质的检测 点免疫结合测定兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体(10g/ml),置酶标板内,4过夜洗板三次,加牛血清白蛋白,置372h封闭稀释菌体蛋白成浓度梯度,稀释待检样品至250g/ml左右,洗板三次,将装备的标准和待检样品加至板内, 置372h将HRP酶联抗抗体,加至板内,置371h洗板十次,参加底物,置3740min参加终止液终止反响放入酶标仪中进展结果分析(5)无菌试验1)抽样: 原液及半成品: 每瓶分别进展, 抽样量0.1%,10ml 成品: 每亚批随机抽样试验, 抽样量与成品数量有关2)检查方法： a.直接接种法 b.薄膜过滤法3)结果断定：适当培养基中培养不少于14天 无菌生长：合格 有菌生长：复试，样品加量进展 有菌生长：不合格 无菌生长：合格(6)内毒素试验鲎试剂凝胶法：鲎试剂与细菌内毒素产生凝结反响五支试管：加样后，封闭管口，37水浴保温1h鲎试剂鲎试剂鲎试剂鲎试剂鲎试剂+供试品供试品内毒素标准液加供试品的内毒素液检查用水ABCED结果断定：缓缓倒转180度凝胶不变形，不滑脱为阳性(7)异常毒性试验进展小鼠和豚鼠两种动物实验(8)热原质试验进展家兔动物实验(9)生物学效价试验进展动物体内实验或细胞培养计数法。