产品微生物检测作业指导书.doc

稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN-ＱＭ-P２8—SOP03版　 　　次A/0生效日期２０0９—９-2９页 次１/1１1.目的　 为产品的微生物检测提供具体作业依据适应范围　　适应于本集团原材料、辅料、半成品、成品过程的微生物检测3.职责 由质量部负责制定、品管部实施，其它部门配合.４工作程序41检验频次和方法同《初始污染菌检测作业指导书》４２实施检测 　４.21接种生理盐水样液,在超净工作台中用无菌方法打开样品，从中随机称取１0ｇ样品,用灭菌剪刀剪碎后加入到１０0mｌ灭菌生理盐水溶液中,于漩涡混合器中振荡2ｍｉｎ（280０次/miｎ),每一种样品取30ｇ，分别接种3管生理盐水样液.待上述样液自然沉降后取上清液作菌落计数，共接种6个皿每个平皿加入1ｍl样液,后用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂15ml倒入平皿内,混合均匀．待琼脂凝固后翻转平皿于3０—３５℃培养３—７D后,计算平板上的菌落数,当平板上的菌落数超过300时,应稀释复测后再计数2 大肠杆菌检测方法 　 　 标准作业规程 　　　　 　 　 　　 　　　　 　 　 标准要求 　 　 　 　取样液5mL接种50mL乳糖胆盐发酵管，置35℃±2℃ 培养24 h，如不产酸也不产气，则报告为大肠菌群阴性。

１)接种乳糖胆盐发酵管二、如产酸产气，则划线接种伊红美蓝琼脂平板，置35℃±2℃培养18～24 h，观察平板上菌落形态典型的大肠菌落为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中心较深的菌落阳性(黄色） (紫色） 阴性2)接种到伊红美蓝平板黑紫色或红紫色,圆形,边缘整齐3)镜检　三、取疑似大肠菌落1～2个作革兰氏染色镜检，镜检为革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌革兰氏阴性杆菌(红色)　 　 　 　 拟制审核批准稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN—QＭ-P2８-SOP03版 次A/0生效日期2009—９—2９页 次２/１1 　 标准作业规程 　 　 　 　 　 　　 　 标准要求 　 　4)接种乳糖发酵管取疑似大肠菌落接种乳糖发酵管，置35℃±2℃培养24 h，观察产气情况产气为阳性,不产气为阴性. 　 阳性（产气)5)结果判定 　 　 　 　 　　 　 　五、结果判定：凡乳糖胆盐发酵管产酸产气，乳糖发酵管产酸产气，在伊红美蓝平板上有典型大肠菌落，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，可报告被检样品检出大肠杆菌。

乳糖胆盐发酵 管产酸产气 伊红美蓝平板上有典型大肠 　 　 　 　　 　 　　乳糖发酵管产气G- 无芽胞杆菌４3绿脓杆菌检测方法　 　 标准图示　　 　 　　 　 　 　 　 标准要求 　 　 1)增菌取样液5 mL，加入到50 mL SCDLP培养液中，充分混匀，置35℃±2℃培养18～24 h如有绿脓杆菌生长，培养液表面呈现一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色从培养液的薄菌膜处挑取培养物，培养液常呈黄绿色或蓝绿色拟制审核批准稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WＮ—QM—Ｐ28-SOP03版 　次A／0生效日期２00９—９—29页　 次3/11 　标准作业规程 　　 　　 　 　 　　 　　 标准要求 　　　　 　 2) 划线接种十六烷三甲基溴化铵 　从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种十六烷三甲基溴化铵琼脂平板，置35℃±2℃培养18～24 h，观察菌落特征绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不长。

菌落扁平,边缘不整,略带粉红色3) 革兰氏染色取可疑菌落涂片作革兰氏染色，如镜检为革兰氏染色为阳性杆菌，可初步判为非绿脓杆菌，如镜检为革兰氏阴性杆菌应进行下列试验革兰氏阴性杆菌4) 氧化酶试验取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻棒挑取可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1％二甲基对苯二胺试液，30 s内出现粉红色或紫红色，为氧化酶试验阳性，不变色者为阴性阳性:红色或紫红色 阴性:无色5) 绿脓菌素试验取2～3个可疑菌落，分别接种在绿脓菌素测定用培养基斜面，35℃±2℃培养24 h，加入三氯甲烷3～5 mL，充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解，待三氯甲烷呈蓝色时，用吸管移到另一试管中并加入1 mol/L的盐酸1 mL，振荡后静置片刻如上层出现粉红色或紫红色即为阳性，表示有绿脓菌素存在拟制审核批准稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN-QM—P28-SOP0３版 　 次A/０生效日期2０09-9-29页 　 次４/11 　标准作业规程 　 　 　 　　 　 　　 　 　　 　 　　标准要求 　 　 6) 硝酸盐还原产气试验 　 挑取被检菌纯培养物接种在硝酸盐胨水培养基中，置35℃±2℃培养24 h，培养基小倒管中有气者即为阳性。

7) 明胶液化试验 　 　 取可疑菌落纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置35℃±2℃培养24h，取出放于4～10℃，如仍呈液态为阳性，凝固者为阴性阴性(凝固） 　阳性(液态)8) 42℃生长试验 取可疑培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置42℃培养24～48 h，有绿脓杆菌生长为阳性 　(生长)阳性 　 　阴性(不生长)5）结果判定被检样品经增菌分离培养后，证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓杆菌试验均为阳性者，即可报告被检样品中检出绿脓杆菌如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出绿脓杆菌 G—杆菌 　 氧化酶阳性 　绿脓菌素阳性 　硝酸盐还原产气　 明胶液化 　4２℃生长拟制审核批准稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN—QM—Ｐ28—SOＰ03版 　 次A/0生效日期2０0９—９-２９页 次５/114.24金黄色葡萄球菌检测方法 　　　标准作业规程 　 　 　 　 标准要求 　 1） 金黄色葡萄球菌在普通琼脂平板上2） 在SCＤＬP培养液中增菌 取样液5 mL，加入到50 mL SCDLP培养液中，充分混匀，置35℃±2℃培养24 h。

　3） 血琼脂培养基上划线从上述增菌液中取1～2接种环，划线接种在血琼脂培养基上，置35℃±2℃培养24～48 h在血琼脂平板上该菌菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈金黄色,圆形，不透明，周围有溶血圈4） 镜检挑取典型菌落，涂片作革兰氏染色镜检，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄状，无芽胞与荚膜,镜检符合上述情况，应进行下列试验：革兰氏阳性球菌（紫色)5） 甘露醇发酵试验取上述菌落接种甘露醇培养液，置35℃±2℃培养24 h，发酵甘露醇产酸者为阳性(黄色)　阴性（紫色) 　(黄色)阳性拟制审核批准稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号ＷN－QＭ—P28-SＯＰ0３版　　 次A/０生效日期２009-9—２９页 次6／1１　 标准作业规程　 　 　 　 　 标准要求 　 　 　 血浆凝固酶试验：玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5 min如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固则为阳性，如两者均无凝固则为阴性。

凡盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再进行试管凝固酶试验；试管法：吸取1∶4新鲜血浆0.5 mL，放灭菌小试管中，加入等量待检菌24 h肉汤培养物0.5 mL混匀，放35℃±2℃温箱或水浴中，每半小时观察一次，24 h之内呈现凝块即为阳性（使试管倒置或倾斜时不流动为阳性）同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物各0.5 mL作阳性与阴性对照6） 血浆凝固酶试验 阳性（凝固） 　 （液体) 阴性7） 结果判定凡在琼脂平板上有可疑菌落生长，镜检为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌 典型菌落　　 　 Ｇ+葡萄球菌 　 　 发酵甘露醇产酸 血浆凝固酶阳性４.2.５溶血性链球菌检测方法 标准作业规程　 　　 　 　 　　 　 　 　标准要求 　 　 1） 增菌取样液5 mL加入到50 mL葡萄糖肉汤，35℃±2℃培养24 h2） 接种到血琼脂平板上将培养物划线接种血琼脂平板，35℃±2℃培养24 h观察菌落特征溶血性链球菌在血平板上为灰白色，半透明或不透明，针尖状突起，表面光滑，边缘整齐，周围有无色透明溶血圈。

灰白色,平板上有溶血圈拟制审核批准稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN-QＭ-Ｐ28—SOＰ03版 　 次A/0生效日期２０09-９－29页　　 次7/11 标准作业规程 　　　 　　 　 　 　　　　 　标准要求　　 3)镜检挑取典型菌落作涂片革兰氏染色镜检，应为革兰氏阳性，呈链状排列的球菌镜检符合上述情况，应进行下列试验：吸取草酸钾血浆0.2 mL(0.01 g草酸钾加5 mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液)，加入0.8 mL灭菌生理盐水，混匀后再加入待检菌24 h肉汤培养物0.5 mL和0.25％氯化钙0.25 mL，混匀，放35℃±2℃水浴中，2 min观察一次(一般10 min内可凝固)，待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间如2 h内不溶化，继续放置24 h观察，如凝块全部溶化为阳性，24 h仍不溶化为阴性革兰氏阳性链球菌(紫色)4） 链激酶试验凝块(阳性)5） 杆菌肽敏感试验将被检菌菌液涂于血平板上，用灭菌镊子取每片含0.04单位杆菌肽的纸片放在平板表面上，同时以已知阳性菌株作对照，在35℃±2。