PLCε对IL-2治疗肾癌的价值分析.docx

PLCε对IL-2治疗肾癌的价值分析肾癌(renalcellcarcinoma,RCC)是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤,1998─2008年,中国肿瘤登记地区RCC的死亡率总体呈增长趋势,年均增长死亡率为7.63%随后,总体趋势趋于稳定总的来说,中国肾细胞癌死亡率的增长男性略高于女性,城市地区低于农村地区[1]磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Cε(phospholipaseCε,PLCε)是利用酵母双杂交筛选技术虫中发现的一种磷脂酶C的同工酶[2],除了拥有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(phospholipaseC,PLC)家族成员共享的保守的x和y催化基序外,还包含一个扩展的N终端区域,这使它具有了其他磷脂酶所不具备的特殊功能,及可被H-ras癌基因的蛋白质表达产物(小G蛋白)和G蛋白双向调节[3,4]已有实验证明,在泌尿系统肿瘤中,PLCε发挥一个致癌基因的作用在前列腺癌中,PLCε通过PPARβ/twist1参与前列腺癌细胞的迁移和上皮–间充质转换(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)过程[5],并可以通过Wnt/β-catenin信号通路对比卡鲁胺耐药的前列腺癌的细胞增殖进行调控[6]。

在膀胱癌细胞中,PLCε可以通过CDC25A影响T24细胞的瓦伯格效应[7],同时,对膀胱癌的EMT和迁移能力具有一定的促进作用[8]在肾癌中,PLCε与促炎细胞因子的释放存在一定的相关性[9]近年来,免疫疗法因其具有副作用小、预后良好的优势,在肾癌的治疗中得到重视大剂量的白细胞介素-2(interleukin2,IL-2)是最早使用的免疫疗法,其主要通过淋巴细胞发挥作用[10],但对肿瘤细胞的影响目前尚不明确PLCε在肾癌中可以引起一定的免疫反应,但是否在IL-2治疗中发挥一定的作用,目前尚不清楚本实验将使用sh-PLCε慢病毒敲减肾癌细胞株786-o中的PLCε,以此为基础来探讨PLCε在IL-2治疗中的作用1、材料与方法1.1细胞株人肾癌细胞株786-o和人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2购于中国科学院上海细胞库,保存于重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室1.2慢病毒PLCε干扰慢病毒(LV-sh-PLCε)及通用阴性对照慢病毒(LV-shNC)由上海吉玛制药技术有限公司构建,序列信息见表11.3主要试剂细胞培养基RPMI-1640和胎牛血清购于Gibco公司;嘌呤霉素购于北京索莱宝科技有限公司;q-PCR引物由Invitrogen公司合成,引物信息见表2;RNA提取试剂盒Trizol、RT-PCR试剂盒和q-PCR试剂盒购于TaKaRa公司;蛋白质提取试剂购于上海碧云天生物技术有限公司;山羊抗兔多克隆抗体、山羊抗鼠多克隆抗体购于杭州联科生物技术股份有限公司;兔抗人单克隆抗体(factorrelatedapoptosis,Fas)、FADD、Caspase-3、C-Flip、Traf2和鼠抗人单克隆抗体Caspase-8购于Bioss生物技术公司;细胞因子IL-2购于Novoprotein科技有限公司;MTT试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司;ficoll试剂购于通用电气医疗集团生命科学部(GEHealthcareLifeSciences);新鲜的健康成年人外周血由本课题组同学友情提供。

表1慢病毒序列表2PCR引物信息1.4实验方法1.4.1细胞培养将肾癌细胞株786-o、人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2常规培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基,后置于37°C、5%CO2的湿度饱和培养箱中培养,待细胞贴壁且生长至80%～90%时,以0.25%胰酶消化并进行传代1.4.2转染sh-PLCε,筛选稳定细胞株将肾癌细胞株786-o细胞消化后,接种于6孔板中(每孔5×104个)待细胞生长融合度达40%～60%,更换培养基,同时分别在其中两个孔中加入2μLPolybrene之后再分别加入5μL的LV-NC、LV-sh-PLCε病毒原液,置于37°C、5%CO2孵箱中孵育48h后观察细胞状态和转染效率细胞株感染病毒后继续传代3次,每次加1μg/mL嘌呤霉素进行筛选,获得786-o-sh-PLCε、786-o-shNC稳定细胞株1.4.3MTT检测IL-2处理细胞的最适浓度在96孔板中每孔铺入200μL细胞悬液(细胞个数约为1500个/孔),使用RPMI-1640完全培养基配制IL-2溶液,设置IL-2浓度梯度分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40ng/mL,使用含不同浓度IL-2的培养基培养细胞,放置于37°C、5%CO2孵箱分别培养24h、48h、72h后,每孔加入10μLMTT试剂,37°C、5%CO2孵箱培养4h终止培养,小心地将孔内上清完全吸出,弃去,每孔加100μLDMSO,37°C振荡10min,使甲臜充分溶解(设置5个对照组,只加入DMSO用以排除试剂影响),490nm处测量吸光度(D)值,并绘制生长曲线。

1.4.4实时定量PCR(q-PCR)常规处理细胞72h,待细胞生长至90%,用Trizol法提取细胞的总RNA,逆转录为cDNA后用SYBGreen法进行q-PCR(以β-actin为内参)反应条件如下:95°C预变性3min;95°C变性10s,退火(温度因基因不同而不同)30s;72°C延伸20s;共40个循环(RT-PCR为30个循环)1.4.5Westernblot检测细胞中相关蛋白质水平37°C、5%CO2条件下培养细胞72h后,热裂解法提取总蛋白质,BCA法测定蛋白质浓度用10%十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsμLfatepolyacrylamide-electrophoresis,SDS-PAGE)分离样品;湿转法转至聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜;5%脱脂奶粉在室温封闭2h,一抗4°C孵育过夜,TBST洗涤5次;辣根过氧化物酶(horse-radishperoxidase,HRP)标记的二抗室温孵育2h;TBST洗涤5次,ECL化学发光,显影分析1.4.6肿瘤细胞与淋巴细胞共培养使用ficoll法提取健康成年人外周血淋巴细胞,与肿瘤细胞一起铺于6孔板中进行接触性共培养,72h后,洗去悬浮的淋巴细胞,收集肿瘤细胞,流式细胞术检测共培养后肿瘤细胞凋亡情况。

1.4.7统计学分析实验结果采用SPSS17.0软件进行统计分析计量资料用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用t检验,P<0.05认为差异有统计学意义2、结果2.1肾癌细胞株786-o中PLCε呈现高表达状态q-PCR和Westernblot结果发现,与肾正常上皮细胞株HK-2对比,肾癌细胞株786-o中,PLCε表达呈过表达状态(P<0.01,图1)2.2转染sh-PLCε慢病毒下调786-o细胞中PLCε的表达q-PCR和Westernblot结果发现,无论是mRNA还是蛋白质水平,感染sh-PLCε慢病毒组的PLCε表达均低于NC组(P<0.01,图2);而空白对照组和NC组的PLCε表达差异无统计学意义(P>0.05,图2)结果表明,转染sh-PLCε慢病毒成功下调786-o细胞内源性PLCε的表达,为后续实验奠定基础2.3转染sh-PLCε慢病毒后细胞凋亡水平增加DAPI染色显示,与NC组相比,sh-PLCε组的细胞开始出现凋亡小体(图3);流式细胞术结果显示,NC组凋亡细胞比例为17.64%,sh-PLCε组凋亡细胞比例为25.27%,重复3次实验后分析2组凋亡比例差异水平,结果显示,二者具有统计学意义(P<0.05,图3)。

两个实验结果均证明,敲减PLCε后,细胞的凋亡水平开始增加2.4敲减PLCε后,Fas/FasL表达水平下降使用q-PCR和Westernblot实验检测敲减PLCε后,Fas/FasL的表达水平,结果显示,无论是在蛋白水平还是mRNA水平,Fas、凋亡相关因子配体(fasligand,FasL)表达水平均降低(**P<0.01,***P<0.001,图4),提示PLCε可能通过Fas/FasL途径来对肾癌细胞凋亡进行调控2.5敲减PLCε后,细胞凋亡信号增强,凋亡抑制信号减弱使用q-PCR和Westernblot实验检测敲减PLCε后,Fas/FasL途径的下游分子,包括接头蛋白FADD、凋亡相关的分子Caspase8、Caspase3以及凋亡抑制相关的分子cFlip、Traf2的表达水平结果显示,无论是在蛋白水平还是mRNA水平,接头蛋白FADD表达差异无统计学意义(P>0.05,图5),凋亡相关分子Caspase8、Caspase3表达增高(P<0.01和P<0.001,图5);凋亡抑制相关的分子cFlip、Traf2表达减低(P<0.01和P<0.001,图5),提示sh-PLCε可能通过增强凋亡信号通路,抑制凋亡抑制信号通路来促进肾癌细胞凋亡。

图1HK-2与786-o细胞中PLCεmRNA以及蛋白表达水平图2转染sh-PLCε慢病毒后,786-o细胞中PLCεmRNA以及蛋白表达水平图3786-o细胞NC组、sh-PLCε组细胞凋亡检测2.6MTT法检测IL-2处理细胞的最适条件使用0、5、10、15、20、25、30、35和40ng/mL,9个浓度的IL-2来处理786-o细胞分别在24h、48h、72h3个时间点来检测细胞的存活率,结果显示,在25ng/mL浓度,72h处理细胞为IL-2处理细胞的最适条件(图6)2.7加入IL-2后Fas、Fasl表达增高使用q-PCR和Westernblot实验检测IL-2处理NC组、sh-PLCε组后,Fas、FasL的表达水平,结果显示,无论是在蛋白水平还是mRNA水平,Fas、FasL表达水平均增高(P<0.01,图7),提示IL-2可能会通过Fas/FasL来影响细胞图4786-o细胞中Fas、FasLmRNA以及蛋白表达水平2.8加入IL-2后,影响Fas/FasL下游分子的表达使用q-PCR和Westernblot实验检测IL-2处理NC组、sh-PLCε组后,Fas/FasL途径的下游分子,包括接头蛋白FADD、凋亡相关的分子Caspase8、Caspase3以及凋亡抑制相关的分子cFlip、Traf2的表达水平,结果显示,无论是在蛋白水平还是mRNA水平,接头蛋白FADD表达水平增高(P<0.01,图8),凋亡相关分子Caspase8、Caspase3表达增高(P<0.01和P<0.001,图8);凋亡抑制相关的分子cFlip、Traf2表达减低(P<0.01和P<0.001,图8),方差分析sh-PLCε转染与IL-2处理2种处理因素对相关分子表达的影响,5个分子中,只有cFlip存在拮抗作用(P<0.05)。

结果提示,IL-2可以通过促进Fas/FasL下游凋亡信号通路,抑制Fas/FasL下游凋亡抑制信号通路来调控肾癌细胞的凋亡情况,并且在cFlip分子的调控上,IL-2处理与shPLCε转染起拮抗作用图5786-o细胞中FADD、caspase8、caspase3、cFlip、Traf2mRNA以及蛋白表达水平图6MTT法检测IL-2处理细胞的最适条件图7IL-2处理后,786-o细胞中Fas、FasLmRNA以及蛋白表达水平图8IL-2处理后,786-o细胞中FADD、caspase8、caspase3、cFlip、Traf2mRNA以及蛋白表达水平2.9淋巴细胞与786-o细胞共培养后,细胞凋亡比例增加Ficoll法提取健康成年人外周血的淋巴细胞,与786-o细胞进行。