重组克隆的筛选方法.doc

重组克隆的筛选方法重组克隆的筛选方法：1、抗性筛选；2、蓝白斑筛选；3、酶切电泳筛选；4、PCR筛选； 5、测序验证； 6、表达筛选；7、生物活性筛选1、抗性筛选—质粒载体携带的筛选标记（AmpR 氨苄青霉素抗性；TetR 四环素抗性；KanR 卡那霉素抗性） 特点：一般用抗性培养基做初级筛选，只能保证有载体转入，不能保证外源基因插入2、蓝白斑筛选--β-半乳糖苷酶 (lacZ)的显色反应 α-互补：lacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），载体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的lacZ可分解培养基平板中的底物X-Gal，生成蓝色物质需要IPTG的诱导表达） 外源基因插入载体后，使载体部分lacZ失活，无法进行α-互补—白斑　 特点：未载入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选；无法确定基因插入的方向；特殊—基因过小，且读框正确，可能无法使载体部分lacZ失活，将产生α-互补，产生蓝斑蓝白斑筛选的原理 分类:生物科学蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。

在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落3、酶切电泳筛选 选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片段的大小 特点：可鉴定外源基因的重组和插入方向；结果可靠但操作比较麻烦；无法检测基因内部的突变4、PCR筛选 通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒 特点：可用2μl菌液做模板，快速，方便，可批量检测；不能检测基因插入方向；不能检测基因内部突变5、测序验证 选取阳性克隆，送公司测序 特点：最可靠的检测方法，可确定基因的重组，插入的方向，基因内部的突变等；价格贵，适于1~2个克隆的验证 ①一次测序反应一般准确测定500bp左右（也有测准800bp，价格贵）②测定的序列靠近引物（起点）20-30bp不准，500bp的序列也不准③质粒测序：测序引物公司提供；PCR产物直接测序：测序引物自己提供，理论上比质粒测序更可靠（注意：a、测序引物必须与模板完全配对；含有mix碱基的引物一般不能测序；b、测序引物长度一般为29个碱基左右，GC含量必须在59%~60%左右6、表达筛选一、SDS-PAGE筛选：小量诱导表达；全菌液裂解后进行SDS-PAGE电泳；重组的表达克隆将在特定的位置出现较浓的蛋白条带。

需加不诱导的对照）特点：1、可检测外源基因的表达一般基因的插入，方向，读框都正确）2、无法筛选不能有效表达的重组质粒二、亲和筛选：50 ml菌液诱导表达；超声破菌；用少量亲和beads吸附上清；SDS-PAGE检测；在特点位点将出现一条蛋白带特点：适用于有亲和Taq的融合蛋白的检测；比SDS-PAGE筛选更灵敏（富集），可靠；比较麻烦三、免疫筛选：用抗体检测目标蛋白；Western blot（最准确）；ELISA (可能会受到交叉反应的干扰）7、生物活性筛选• 酶：测定酶活；• 亲和蛋白：与亲和底物作用• 其它的生物活性。