毕赤酵母表达实验手册.docx

xx酵母表达实验手册（作参考）部分试剂中英文名称：小牛肠碱性磷酸酶（C旧、AOX1（alcoholoxidase,醇氧化酶）10*YNB（含有硫酸镂、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）500*B（0.02%生物素Biotin）、100*H（0.4%Histidine组氨酸）10*D（20%Dextrose葡萄糖）、10*M（5%Methanol甲醇）10*GY（10%Glycerol甘油）、100*AA（0.5%ofeachAminoAcid,各种氨基酸）、1M磷酸钾溶液（potassiumphosphatebuffer，pH6.0）Sorbitol（山梨醇）、磷酸钾溶液（potassiumphosphatebuffer）YEPDM（YeastExtractPeptoneDextroseMedium酵母浸出粉/胰蛋白月东/右旋葡萄糖培养基）MinimalGlycerolMedium（最小甘油培养基）YPD培养基的配制：每（L）液体预¥M合物（50g/L）终浓度酵母提取物10g250g1%t白栋20g500g2%f萄糖20g500g2%X注：配制YPD培养基时，20%（10为葡萄糖溶液最好采用单独过滤除菌或高压灭菌（在灭菌后再加入到其他各种成分），以免在高压灭菌时培养基变黑并妨碍酵母菌的最佳生长。

派极限培养基｛合成葡萄糖（SD）培养基｝每（L）液体预¥M合物（50g/L）终浓度YNB-AA/AS1.7g68g0.17%（NH4）2SO45g200g0.5%葡萄糖20g800g2份：这种极限培养基可以培养没有特殊营养要求的酵母菌，但更多时候这种培养基是作为一种待添加其他成分的极限培养基（见下文提到的CM省却成分培养基）完全极限（CM）省却成分培养基（每L中含）：省却成分粉剂1.3g（见表13.1.1）YNB-AA/AS1.7g（NH4）2SO45g葡萄糖20g*(另外，后3种成分可用27g极限培养预混合物代替)CM省却成分粉剂(CMdropoutpowder)即所谓的减少成分粉剂(minuspowder)或删除成分粉剂(omissionpowder),它们缺少了表13.1.1中某一种营养成分但含其他营养成分完全极限(CM)省却成分培养基一般用于检测与生物合成途径有关的基因，或转化实验中用于筛选基因的功能大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。

与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母(Saccharomyces.Cerevisiae分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达虽然干扰素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的维特，因此引起产量下降同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的下降为克服酿酒酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母(methylotrophicyeast)为代表的第二代酵母表达系统［2］甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等.以Pichia.pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1 、2、3］：⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。

⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点利用强效可调控启动子AOX1,已高效表达了HBsAgTNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜子扩大为工业规模［4］目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的.Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品［2、3］近年来，Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经有300多种外源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统。

毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut+,即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts,即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达［5］．包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等表达载体都是穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞为使产物分泌胞外，表达载体还需带有信号肽序列毕赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效分泌表达胞外表达需要在外源蛋白的N末端加上一段信号肽序列，引导重组蛋白进入分泌途径，可使蛋白质在分泌到胞外之后获得准确的构型毕赤酵母对外源蛋白自身的信号序列识别能力差，在本试验中所使用pPICZ%频粒，其信号肽来自酿酒酵母的％-交配因子（factor）,能很好的达到以上的要求并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有Zeocin抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利［1、2］。

pPICZa质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点简介如下：⑴具有强效可调控启动子AOX1（alcoholoxidase,醇氧化酶）；⑵具有Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选，即在YPD拜板上生长的转化子中，100％都有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程［5］在操作过程中，Zeocin也可用来筛选含表达载体pPICZ%A的大肠杆菌转化子，不必另外使用Amp,经济而又简便⑶在表达载体A0X15端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多克隆位点下游有A0X13’端终止序列⑷分泌效率强的信号肽％-factor.Invitrogen公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为广泛的酵母表达系统，其主要的优点有：醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且．有利于产物的纯化一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制1 ．1各种母液的配制10*YNB（含有硫酸镂、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4c保存。

34g酵母基础氮源培养基（无硫酸镂）+100g硫酸镂，溶于1000ml水中，过滤除菌500*B（0.02%生物素Biotin）4c保存期为1年20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌100*H（0.4%Histidine组氨酸）4c保存期为1年400mg的1纽氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌10*D（20%Dextrose葡萄糖）保存期为1年200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌10*M（5%Methanol甲醇）保存期为2个月将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌10*GY（10%Glycerol甘油）保存期为1年以上将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌100*AA（0.5%ofeachAminoAcid,各种氨基酸）4c保存期为1年分别将500mg的L卷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L垸氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌1M磷酸钾溶液（potassiumphosphatebuffer，pH6.0）,将1mol/L的K2HPO4容?夜132ml与1mol/L的KH2PO4容?夜868ml混匀，其pH为6.0,如需调节pH,则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。

1.2常用溶液及缓冲夜1.2.1碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：溶液I:50mmol/Lglucose,100mmol/LEDTA25mmol/LTris—HCI(pH8.0)溶液n：0.2mol/LNaOH,1%SDS(临用时配制)溶液m:29.44gKAc，11.5mlAceticacid,力口ddH2O至100ml4℃保存1.2.2 10%甘油(Glycerol)：将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌保存期为1年以1.2.3 Rnase-H2O：1ulRnase加入1ml灭菌ddH2O4c保存1.2.4 TE缓冲液：10mmol/Tris-CI(pH8． 0)，lmmol/LEDTA(pH8.0)125STES冲液：0.1mol/L,10mmol。