重组DNA技术00002.ppt

重组重组DNA技术技术 第二章第二章重组重组DNA技术技术又称又称DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验:从S型细菌中分别抽提出DNA、蛋白质和荚膜物质，并把每一种成分同活的R型细菌混合，悬浮在合成培养液中结果发现只有DNA组分能够把R型细菌转变成S型细菌重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验O. T. Avery（1944年）证明，遗传信息的携带者是DNA；J. D. Watson和F. H. C. Crick提出了DNA分子的双螺旋结构模型（1953年）M. Meselson和F. W. Stahl证实了DNA的半保留复制（1958年）F. H. C. Crick提出遗传信息传递的“中心法则”（1958年）F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型（1961年）M. W. Nirenberg等人破译了氨基酸的64个遗传密码（1966年）1972年，P. Berg等率先完成了DNA体外重组(1980年诺贝尔化学奖)1973年，S. Cohen等进一步实现了重组DNA的转化1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。

1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1982年，美国食品与药物管理局批准首例基因工程产品--人胰岛素1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉人体生长激素释放激素(SS)抑制和调节多种激素的作用从动物脑中提取:5mg---5050万只羊脑万只羊脑基因工程9 9升大肠杆菌升大肠杆菌 培养液Ø相关概念相关概念– DNA克隆克隆– 工具酶工具酶– 目的基因目的基因– 基因载体基因载体Ø基本原理基本原理 Ø重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系主要内容：主要内容：第一节第一节、重组、重组DNA技术相关概念技术相关概念 Concept Associated to Recombinant DNA TechnologyØ克隆克隆(clone):是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的群体Ø获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，，即无性繁殖即无性繁殖一）（一） DNA克隆克隆Ø技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone) （即（即DNA 克隆）克隆） 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）　　是在体体外外将不同来源的特特异异基基因因或或DNADNA片片段段插入病毒、质粒或其它载载体体分子，构建重组DNA分子，然后将重组DNA导入到合适的受受体体细细胞胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆”），筛选出含有目的基因的转化子细胞，再 进 行 扩 增 、 提 取 获 得 大 量 同 一 DNA分 子(recombinant DNA, chimera DNA） ，即DNA克隆，因此DNA重组技术又称为DNA克隆（DNA cloning）。

ØDNA克隆克隆Ø生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等程、细胞工程等Ø Ø基因工程基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNADNA工艺学或工艺学或重组DNA技术技术(recombination DNA technique)(recombination DNA technique)，基因操作，基因操作(gene manipulation)(gene manipulation)、遗传工程、遗传工程(genedc engineering)(genedc engineering)(二二)目的基因目的基因•进行DNA重组的目的主要有两方面：①① 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA ②② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）这些使我们感兴趣的基因或使我们感兴趣的基因或DNA序列序列就是目的基因(target DNA)目的基因有两种类型： cDNA(complementary DNA):在体外经反转录合成的．与mRNA互补的DNA。

基因组DNA(Genomic DNA):代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列(三三)载体载体一.表达载体(expression vector):为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多多肽链而特意设计的载体称为肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体二.克隆载体(Cloning vector):为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设序列被扩增而特意设计的载体称为计的载体称为克隆载体克隆载体第二节第二节 重组重组DNA技术操作的基本过程技术操作的基本过程Ø基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为： 分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体  目的基因目的基因基因载体基因载体重组体重组体分切接转筛表总总体体技技术术路路线线 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程第二节第二节 重要的工具酶重要的工具酶Ø 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶Ø DNA聚合酶聚合酶ⅠØ 逆转录酶逆转录酶Ø T4DNA连接酶连接酶Ø 碱性磷酸酶碱性磷酸酶Ø 末端转移酶末端转移酶Ø Taq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5´磷酸基和磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶Ⅰ①①合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接②②缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针③③DNA序列分析序列分析④④填补填补3´末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。

常用于性常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶①①合成合成cDNA②②替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3´羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基一一.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶 (restriction endonuclease, RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列, 并并在在识别位点或其周围切割双链识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶的一类内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HⅠØ定义：定义：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。

用罗马数字表示发现的先后次序Ø命名：命名：Hin dⅢ 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶ⅠⅠ、、ⅡⅡ、、ⅢⅢ（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用ⅡⅡ型）型）分类：分类： ⅡⅡ型限制性核酸内切酶的作用特点型限制性核酸内切酶的作用特点—— 回文结构回文结构(palindrome) 大部分Ⅱ型限制酶能够识别由4个～8个核苷酸组成的特定序列Ⅱ型酶识别具有回文结构的核苷酸序列（图2-2）回文”意为顺读和倒读都一样的词语切口切口 ：：平端切口平端切口、、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGGBam HⅠGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口来来源源不不同同的的限限制制酶酶，，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+BstⅠØ同功异源酶：同功异源酶：有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，，但但切切割割DNA后后，，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，，称称为为同同尾尾酶酶。

这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端(compatible end)Bam Bam HⅠHⅠBgBg lⅡlⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G++++ATCTAG GATCT AØ 同尾酶同尾酶名　　称　　名　　称　　 　　识别识别序列及切割位点序列及切割位点名　　称　　　　　名　　称　　　　　识别识别序列及切割点序列及切割点切割后切割后产产生５生５’突出末端突出末端:BamHⅠⅠ 5’…G▼GATCC...3’▼GATCC...3’Bgl ⅡⅡ 5’…A▼GATCT...3’▼GATCT...3’EcoREcoR Ⅰ Ⅰ 5’…G▼AATTC...3’▼AATTC...3’Hind ⅢHind Ⅲ 5’…A▼AGCTT...3’ ▼AGCTT...3’ HpaHpa Ⅱ Ⅱ 5’…C▼CGG...3’ ▼CGG...3’ MboMbo Ⅰ Ⅰ 5’…▼GATC...3’ ▼GATC...3’ NdeNde Ⅰ Ⅰ 5’…GA▼TATG...3’▼TATG...3’切割后切割后产产生生3’突出末端突出末端:Apa ⅠⅠ 5’…GGGCC▼C...3’▼C...3’Hae ⅡⅡ 5’…PuGCGC▼Py▼Py...3’...3’Kpn ⅠⅠ 5’…GGTAC▼C...3’▼C...3’Pst ⅠⅠ 5’…CTGCA▼G...3’▼G...3’Sph ⅠⅠ 5’…GCATG▼C...3’▼C...3’切割后切割后产产生平末端生平末端:Alu ⅠⅠ 5’…AG▼CT...3’▼CT...3’EcoR ⅤⅤ 5’…GAT▼ATC...3’▼ATC...3’HaeHae Ⅲ Ⅲ 5’…GG▼CC...3’▼CC...3’PvuPvu Ⅱ Ⅱ 5’…CAG▼CTG...3’▼CTG...3’SmaSma Ⅰ Ⅰ 5’…CCC▼GGG...3’▼GGG...3’ 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶二、二、DNA连接酶连接酶(基因工程的基因工程的“缝纫针缝纫针”) ：： 1. T4噬菌体DNA连接酶：两个不同片段双链DNA存在互补粘性末端（Km=0.6µmol/L)或平末端(Km=50µmol/L)。

DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导 2. 大肠杆菌DNA连接酶:不能催化平末端DNA分子的连接 三、三、DNA聚合酶聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段): 大肠杆菌DNA聚合酶I具有三种酶活性 Klenow片段具有二种酶活性（去除5’ 3’外切酶活性）2. Taq DNA聚合酶: 耐热（75-80℃），分子量65kD,也具5’ 3’外切酶活性反转录酶(RDDP):多功能酶，无3’ 5’DNA外切酶活性，具有3’ 5’RNA外切酶活性第四节第四节 常用载体常用载体Ø 定义定义载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具具备的条件载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具具备的条件:①①具有自主复制能力具有自主复制能力②②有多个单一限制性内切酶的酶切位点（有多个单一限制性内切酶的酶切位点（MCS））③③具有选择性遗传标记具有选择性遗传标记④④分子量小分子量小⑤⑤拷贝数高（拷贝数高（10个～个～200个个/细胞）细胞）⑥⑥具有较高的遗传稳定性具有较高的遗传稳定性Ø 常用载体常用载体:质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA1.1.质粒质粒 (plasmid):是细菌内携带的染色体外的小型双链环状是细菌内携带的染色体外的小型双链环状DNADNA，，能独立进行复制。

能独立进行复制特点特点: : 1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细胞内独立自分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细胞内独立自主复制；有较高的拷贝数主复制；有较高的拷贝数2.具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择3.具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点便于外源基因的插入具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点便于外源基因的插入常用质粒载体常用质粒载体（一）（一） pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA通过重组技术构建成，长度为通过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点：，特点：（（1）含有复制起始点和复制调节信号；）含有复制起始点和复制调节信号；（（2）有单个）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目的基因；酶切位点，可切开插入目的基因；（（3）有抗四环素基因）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因和抗氨苄青霉素基因 Amp+，便于，便于重组体细胞的筛选重组体细胞的筛选（二）（二） pUC系列载体系列载体:由由pBR质粒与质粒与M13噬菌体构建而成，长度为噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点：，特点：①①具有更小的分子量和更高的拷贝数。

具有更小的分子量和更高的拷贝数②② “蓝蓝白白斑斑”筛筛选选: pUC载载体体中中的的LacZ´基基因因可可编编码码β-半半乳乳糖糖苷苷酶酶（（β-Gal））N端端的的α-肽肽链链，，该该α-肽肽与与宿宿主主细细胞胞(如如E.coli JM109））中中F´因因子子上上的的LacZ´△△M15基基因因（（α-肽肽缺缺陷陷型型））的的产产物物互互补补，，产产生生完完整整的的、、有有活活性性的的β-半半乳乳糖糖苷苷酶酶，，分分解解生生色色底底物物（（X-gal））形形成成蓝蓝色色菌菌落落当当外外源源基基因因插插入入MCS后后，，LacZ´α-肽肽基基因因的的读读码码框框被被破破坏坏，，不不能能合合成成完完整整的的β-半半乳乳糖糖苷苷酶酶分分解解底底物物X-gal，，菌菌落落呈呈白白色色称称为为“蓝蓝白白斑斑”筛筛选EcoRⅠSacⅠKpnⅠSmaⅠBamHⅠXbaⅠSalⅠPstⅠSphⅠHind ⅢpUC19(2 686bp)AmprLacZ´ Oriori pUC19质粒载体图 （三）其它质粒载体1．能在体外转录体外转录克隆基因的质粒载体: T7、SP6的启动子(RNA聚合酶附着位点)2．穿梭穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）: 具有两种不同复制起点和选择标记,在原核和真核细胞之间往返穿梭.（四）T-A克隆载体多克隆位点两侧的3´末端携带有未配对的T碱基。

由于许多耐热的DNA聚合酶（如Taq、Tth等）扩增时都有在PCR产物3´末端加上A碱基的特性，因此在连接酶的作用下可直接将PCR产物插入到T-A载体中获取、连接外源DNA不受酶切位点的限制二、噬菌体载体二、噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒一）λ噬菌体载体1．λ噬菌体的特点 线状双链DNA，全长48 502bp，由左右两臂组成，两端为12碱基组成的彼此完全互补的5´单链突出黏性末端，称为cos位点感染细菌后，可进入溶菌生命周期及溶源生命周期优点：可插入较大外源DNA片段（可达23kb）；感染效率远高于质粒载体 2．λ噬菌体载体的构建优点：可插入较大外源DNA片段（可达23kb）；噬菌体的感染效率高λ噬菌体作为载体用于分子克隆的示意图DNA重组体外包装携带外源DNA有感染性的病毒颗粒感染大肠杆菌（二）粘粒载体结构与特点：1．含有cos黏性末端及与噬菌体包装有关的短序列 2．含有抗药性标记（如Ampr基因）和自主复制成分 3．具有限制性内切酶位点 4．粘粒分子小粘粒分子小 如pJB8为5.4kb，所以可插入大片段的外源DNA（可达45kb）5．某些粘粒若接上能在真核细胞生活的元件及选择标记，便可作为穿梭载体在真核细胞中生存及表达。

（三）M13噬菌体载体M13是一种丝状单链噬菌体，6 407bp，为闭环单链闭环单链DNAM13只能感染具有F伞毛的雄性大肠杆菌，在细菌内复制时形成双链DNA，这种复制型（replication form，RF）M13相当于质粒，可用作基因克隆载体三、人工染色体载体三、人工染色体载体酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome vector，YAC）是第一个成功构建的人工染色体载体,主要包括以下调控元件：①着丝粒（centromere，CEN），以保证染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子代细胞；②端粒（telomere，TEL），作为染色体复制所必需的成分，可防止染色体被核酸外切酶降解而缩短；③复制起始点和限制性酶切位点；④选择标记；⑤原核序列及调控元件：复制起始点、Ampr基因等，以便于在大肠杆菌中操作EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切EcoRⅠ酶切连接YAC结构图及基因克隆过程 四、病毒载体四、病毒载体质粒载体、噬菌体载体主要以原核细胞作为宿主细胞为实现真核基因表达或基因治疗的需要，已发展了用动物病毒改造的病毒载体等有两类：整合型和游离型（一）反转录病毒载体单正链RNA病毒特点：具有广泛的哺乳动物细胞宿主；可主动感染分裂细胞,反转录生成双链DNA，可整合到宿主染色体中，持续表达外源基因局限性：只能感染并整合到增殖分裂期的细胞；装载容量比较小，仅达8kb；有诱变危险 （二）腺病毒载体腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒优点：可插入大片段外源基因，可达35kb；宿主范围广，尤其人类是其自然宿主；可感染分裂期和非分裂期细胞；不整合，瞬时表达，因而安全性好。

不足：病毒基因组较大，构建载体较复杂；几乎可感染所有细胞，缺乏特异性；载体不发生整合，只能短暂表达第五节第五节 目的基因的获取和体外重组目的基因的获取和体外重组1.化学合成法：化学合成法：较短的基因（较短的基因（60-80bp60-80bp））要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library):3.cDNA文库文库(cDNA library):4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)一一.目的基因的获取目的基因的获取:1.1.化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列较短的基因（较短的基因（60-80bp60-80bp））用途：用途：PCRPCR引物引物, , 测序引物测序引物, , 定点突变定点突变, , 核酸杂交探针核酸杂交探针组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合2.从基因组从基因组DNA文库获取目的基因文库获取目的基因基因组基因组DNA(genomic DNA):指代表一个细胞或生指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有物体整套遗传信息的所有DNA序列序列限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos~20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制3. 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶ⅠⅠ碱水解碱水解 T T T TcDNA:指经反转录合成的、与指经反转录合成的、与RNA (mRNA或病毒或病毒RNA)互补的单互补的单链链DNA。

以单链以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链为模板、经聚合反应可合成双链cDNAPCR技术的基本过程模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffer预变性预变性模板模板模板模板DNADNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBufferTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶循循环环仪仪9494oC5’94℃94℃55 ℃55 ℃72 ℃72 ℃4.PCR4.PCR技术获取目的基因技术获取目的基因技术获取目的基因技术获取目的基因: :二二. .外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接: :体外重组体外重组方式方式：：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接1.粘性末端连接粘性末端连接DNA体外重组本质上是一个酶促反应过程，在DNA连接酶的催化作用下，将外源DNA分子与载体DNA分子连接成一个重组分子的过程连接方式:（一）黏性末端连接（二）平末端连接（三）同聚物加尾连接（四）人工接头连接（五）T-A克隆Bam HⅠ切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15ºCGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam HⅠⅠ切割切割载体载体DNA用用Bam HⅠ切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接Eco RⅠ切割位点切割位点Bg lⅡ切割位点切割位点+ +EcoRⅠ+ Bg lⅡ双酶切双酶切Eco RⅠ+ Bg lⅡ双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15ºC重组体重组体2.平端连接平端连接 •限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端•粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：适用于：目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15ºC重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连在在末末端端转转移移酶酶(terminal transferase) 的的作作用用下下，，在在DNA片片段段末末端端加加上上同同聚聚物物序序列列、、制造出粘性末端，再进行粘端连接。

制造出粘性末端，再进行粘端连接3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接DNA连接酶同聚物尾巴同聚物加尾法连接重组DNA分子 由平端加上新的酶切位点，再用限制由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接 4.人工接头人工接头(linker)连接连接利用人工合成的接头连接重组DNA分子（五）T-A克隆•T-A克隆策略是一种直接将PCR产物插入到载体中的方法一、重组一、重组DNADNA分子的导入分子的导入选定的受体细胞应具备的条件：1. 易于接纳重组DNA分子导入；2.对载体的复制、扩增和表达无严格限制；3.不存在特异性降解外源DNA的酶系统；不对外源DNA进行修饰；能表达重组体分子所提供的某种表型特征常用的导入方法常用的导入方法: : （一）转化（transformation）（二）转染（transfection）（三）感染（infection）第六节第六节 重组重组DNA分子的导入和筛选与鉴定分子的导入和筛选与鉴定2）转化方法1.氯化钙法：氯化钙法：细菌处于低温、细菌处于低温、低渗低渗CaCl2溶液中，菌细胞溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成壁通透性增加，菌体膨胀成球形，经短暂热休克后重组球形，经短暂热休克后重组DNA易进入易进入2.电穿孔法：电穿孔法：除特殊仪器外除特殊仪器外比氯化钙法更简单，使用时比氯化钙法更简单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、注意电场强度、电脉冲长度、DNA浓度等参数。

浓度等参数特殊处理受体细胞细胞膜特性改变CaCl2处理受体细菌受体细菌50-100mmol/LCaCl2 感受态感受态细菌细菌重组体重组体转转入细菌入细菌转染转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程•方法：方法：•磷酸钙转染磷酸钙转染• DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染• 电穿电穿孔孔 :操作简单且转染效率高，几乎可转染任何细胞用于瞬时表达或稳定表达但是它需要专门仪器，确定最佳实验条件• 脂质体转染脂质体转染 :脂质体（liposomes）是一种人造类脂膜.用脂质体包裹DNA，瞬时表达和稳定表达，操作简单，转染效率高，重复性好，且毒性低、包装容量大，昂贵• 显微注射显微注射:转染效率高，但需要一定的仪器和操作技巧主要用于稳定表达(一）根据重组载体的遗传表型进行筛选 1．根据载体的抗药性标记筛选 2．根据载体的抗药性标记插入失活选择3．根据β-半乳糖苷酶显色反应筛选 4．根据插入的外源基因性状进行筛选 （二）限制性核酸内切酶酶切鉴定（三）核酸分子杂交法（四）PCR法（五）免疫化学检测法 ( (六六) DNA) DNA序列检测序列检测二二.重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定1.抗药性标记选择抗药性标记选择AmprTetrBamHⅠ位点BamHⅠ酶切BamHⅠ酶切DNA连接酶目的DNA重组质粒大肠杆菌含Amp平板含Amp平板含Tet平板 2.抗药性标记插入失活选择3．根据．根据β-半乳糖苷酶显色反应筛选半乳糖苷酶显色反应筛选 :标志补救标志补救标志补救标志补救lacZAmN2H 片段片段COOHCOOH 片段片段X-galLac Z蓝色化合物蓝色化合物X-gal（（LacZLacZ基因基因 N N端序列）端序列）插入片段插入片段（（LacZLacZ基因失活）基因失活）LacZLacZ基因基因 N N端序列端序列LacZLacZ酶酶 α互互补补利用利用α互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18 （二）限制性核酸内切酶酶切鉴定凝胶电泳检测加样孔DNA MarkerDNA Marker空质粒空质粒重组质重组质粒粒 重重组质粒酶切组质粒酶切重组质粒的重组质粒的PCRPCR扩增片段扩增片段原位杂交原位杂交（三）核酸分子杂交法:菌落杂交筛选法菌落杂交筛选法（四）PCR法•某些载体的MCS两侧存在保守的序列，如pGEM系列载体的MCS两侧是T7及SP6启动子序列，可根据此序列设计引物，对提取的重组质粒进行PCR扩增，不但可快速扩增插入的目的片段，而且可以直接进行DNA序列分析。

•如果已知目的基因的全序列或其两端的序列与全长，可设计合成一对引物，以转化菌的质粒DNA为模板进行PCR扩增，若PCR产物与目的基因的预期长度相一致，那么即可初步筛选出含重组体的阳性菌落鸡的鸡的β肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出( (五五) )免疫化学检测法免疫化学检测法( (六六) ) DNADNA序列检测序列检测ACTGAAGGCT表达体系的建立：表达体系的建立：Ø 表达载体的构建表达载体的构建Ø 受体细胞的建立受体细胞的建立Ø 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化第七节第七节 克隆基因的表达克隆基因的表达Ø 标准：标准：选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点Ø E.coli表达体系的不足表达体系的不足：：不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA；；不能加工表达的真核蛋白质；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ；很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白1. 原核表达体系原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用表达体系最为常用)大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌Ø 优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累Ø 缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济Ø 2.2.真核表达体系（真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）酵母、昆虫、乳类动物细胞）表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱表达载体表达载体YEpI PT的物理图谱的物理图谱真核表达载体大多是穿梭载体, 通常包括以下元件：•1．启动子 包括SV40、CMV、RSV及LTR等。

•2．增强子 •3．剪接信号•4．终止信号和PolyA化信号•5．遗传选择标记 •胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（neor）等•新霉素抗性选择系统 新霉素的类似物G418（geneticin）对真核和原核细胞均有毒性表达载体中携带的neor基因编码的磷酸转移酶能使G418失活，所以当真核细胞中导入了含neor基因的载体后，转染细胞就可以在含有G418的培养基中生长而得以筛选该选择系统适用于所有真核细胞1. 1.目的基因表达产物的检测目的基因表达产物的检测蛋白质的PAGE对照 样品 MarkerMarker2.2.目的蛋白的分离纯化目的蛋白的分离纯化分子筛亲和柱离子交换抗原抗体目的蛋白重组重组DNA技术与医学技术与医学的关系非常密切并前景远大的关系非常密切并前景远大DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective一、疾病基因的发现与克隆一、疾病基因的发现与克隆Ø 疾病基因发现的典型例子疾病基因发现的典型例子: 脆性脆性X综合征综合征:脆性脆性 X 染色体是指在染色体是指在 Xq27 ～～ Xq28 带之间的染色体呈带之间的染色体呈细丝样，由于这一细丝样部位易发生断裂。

故称脆性部位（细丝样，由于这一细丝样部位易发生断裂故称脆性部位（ fragile site ）其典型的特征为中度到重度的智力障碍，巨睾丸大耳朵、语言障碍、智力低下，智商（ IQ ）为 0 ～ 50 由于女性有两条 X 染色体，多为携带者，其中 2/3 智力正常， 1/3 有轻度智力低下 分子遗传学诊断:已基本取代染色体分析,主要检测FMR1 基因CGG重复扩展及甲基化状况目前有两种方法:多聚酶链反应(PCR) 和Southern 印迹二、生二、生物制药物制药Ø利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为有望成为2121世纪的支柱产业世纪的支柱产业 Ø美国美国Eli Lilly公司于公司于19821982年首先利用重组年首先利用重组DNADNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始迄今为止，已有生物工程药物时代的开始迄今为止，已有5050多种基因工程药物上市，近千种处于研发多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。

了不可估量的社会效益和经济效益 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(  1b,  2a,   2b,  )抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱。