功能基因组学资料.ppt
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功能基因组学 李家大 lijiada@ 遗传疾病 基因鉴定 模型建立 基因功能研究 治疗/诊断 1953年,Watson & Crick提出DNA双螺 旋结构模型 2003年4月14日，国际人类基因组宣布 ：人类基因组列图--“完成图”提前绘制成功 人类基因组计划的信息 人类基因组大小约为2.9-3.2 Gb； 人类基因组中编码蛋白的序列不足5% ； 人类基因组中有大约30，000个功能基 因（即编码蛋白质）； 其中将近40%的基因功能尚不清楚 功能基因组学就是动态的来研究 基因的转录，翻译以及蛋白蛋白之间 的相互作用 I：转录水平 RNA表达水平的研究 基因芯片 定量PCR 差异显示PCR 原位杂交 Northern印迹 DNA array/gene chip基因芯片 Real-time Quantitative PCR （qPCR，实时定量PCR） PCR-Polymerase Chain Reaction Exponential Linear Plateau Taqman probe vs. SYBR Green dye Ct: Cycle threshold Data analysis 原位杂交 In situ hybridization 利用标记的特定RNA做为探针，与细胞 或组织切片中的mRNA进行杂交，从而对特定 基因进行精确定量定位的过程。
原位杂交 II：转录后调控 RNAi (RNA interference) microRNA (miRNA) siRNA (small interfering RNA) MicroRNA的发现 • MicroRNA (miRNA) 是小的非编码 RNA（21-23nt)，它在翻译水平上来 调节真核基因的表达 • Victor Ambros 在1993年研究线虫发 育时序时发现来Lin-4 miRNA,它控制 着线虫从L1期到L2期的转化 miRNA Processing and Activity RISC: RNA-induced silencing complex siRNA (small interfering RNA) Andrew FireCraig C Mello control progeny of injected worm unc-22 dsRNA Gene silencing by dsRNA less mRNA, less protein = gene silencing SiRNA mechanism in C.elegans: basic scheme miRNA和siRNA的差异 miRNA来自长的单链RNA，而siRNA来自长的双链 RNA； miRNA与靶mRNA不完全互补，但是siRNA完全互 补； miRNA与靶mRNA结合，抑制其翻译；siRNA与靶 mRNA结合造成其降解； miRNA往往可以抑制许多序列相似的mRNA的翻译 ，但是siRNA只造成特定基因的降解。
RNAi的应用 基础研究： 降低基因表达(Gene knockdown) 临床应用 抗肿瘤、抗病毒….. III：蛋白质水平 蛋白质是生物活动的主要执行者 结构蛋白 酶 激素 神经递质 受体 抗体 转录因子 …… 蛋白质研究手段 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE)； 双向电泳（等电聚焦+SDS-PAGE)； 质谱； Western印迹； 免疫组化； …… SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以根据电荷和分子质量的差异来分 离蛋白质 当阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate, 简称SDS)与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负 电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分 子间的电荷差别降低乃至消除 同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致 ，所以各种SDS-蛋白质复合物电泳时的泳动率差异，就 反映了分子质量的不同 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳，利用等电点不同分离蛋白质 水平，X-轴） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：利用分子量大小不 同分离蛋白质。
垂直，Y-轴） 二维 (Two dimensional) 凝胶电泳 二 维 凝 胶 电 泳 等电点由低到高 分 子 量 由 高 到 低 质谱，顾名思义就是可以测量物质质量的 仪器蛋白质或者蛋白酶降解的多肽片段可以 通过质谱仪绘制出各组分的分子量图谱，然后 对比数据库中的蛋白质或其降解肽段的质量， 从而推算被测定蛋白质的身份(identity) 质谱技术 二维电泳和质谱结合分析蛋白质功 能示意图 Western 印迹 目的蛋白 一抗 酶标的二抗 免疫组化 Immnuohistochemistry 免疫组化 IV：蛋白质相互作用 研究一个蛋白质与一些已知蛋白质之间的 相互作用，可以推断该蛋白质的生理生化功能 研究蛋白质相互作用的方法主要有： 亲和层析 Co-Immunoprecipitation Yeast Two-hybrid Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Surface Plasmon Resonance (SPR) 亲和层析 将目标蛋白固定在亲和层析介质上(如 Sepharose 4B)，让细胞蛋白通过层析柱，与目标蛋 白结合的蛋白质被留在层析柱上，然后洗脱下来， 用质谱分析等方法进行鉴定。
免疫共沉淀 (co-immunoprecipitation，co-IP) 利用抗原和抗体间的反应特异性，用抗体将目 标蛋白以及与目标蛋白相互作用的蛋白质共同沉淀 下来的方法 免疫共沉淀 酵母双杂交系统是在1989年由纽约州立大学 的Stanley Fields等初步提出并建立的，是在酿酒 酵母中研究蛋白质之间相互作用的一种非常有效的 分子生物学方法 将相互作用的两个蛋白质分别与转录因子的 DNA结合域 (DNA-binding domain)和转录激活域 (Activation domain)融合，在酵母细胞中通过报告 基因的表达情况反映两个蛋白质之间的相互作用 酵母双杂交技术 酵 母 双 杂 交 原 理 酵母双杂交筛选 Surface Plasmon Resonance (SPR，表面等离子体共振) 1. One interaction partner (Y) is bound to the metal film while the other (red balls) partner Is injected over the surface. 2. Amount of bound protein is quantified based upon angle of reflected light. 3. Real time association and dissociation of a protein-protein interaction can be quantified. Surface Plasmon Resonance (SPR) Frster/Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET) A non-radiative, dipole-dipole coupling process, transfer energy from an excited donor fluorophore to an acceptor fluorophore in very close proximity (typically within 10nm). 小结 转录水平：基因芯片，qPCR，原位杂交等 转录后调控：miRNA，siRNA 蛋白质水平：SDS-PAGE，2D，MS，免疫组化 蛋白质相互作用：Y2H，co-IP，SPR，FRET等 Please visit our website for more information. 。
