多粘类芽胞杆菌菌株M-1启动子片段的克隆及绿色荧光蛋白的表达.pdf

农业生物技术学报，2010年，第18卷，第4期，第78801 0， 8， 7 792 研究报告 粘类芽胞杆菌菌株婧婧王爽王琦 梅汝鸿 中国农业大学植物病理学系，农业部植物病理学重点开放实验室，北京100193 通讯作者．要应用启动子探针载体多粘类芽胞杆菌(株列启动子活性片段，通过氯霉素(m)浓度梯度筛选出片段 将这3个具有启动子活性的片段与来自得过热激转化E 光显微镜下观察到明亮的绿色荧光，表明筛选到的启动子片段具有良好的启动外源基因 转录的功能同时利用此表达载体标记本实验筛选得到的生防蜡样芽胞杆菌(株 得了905( 一5、 一8和 一17)，通过荧光显微镜观察，发现转入达载体体有明亮的绿色荧光，而转入关键词多粘类芽胞杆菌，蜡样芽胞杆菌，启动子， 标记 一1 i t g“00193，au~or，i@0．3969／j．674—7968．2010．04．026 of a of hi m)p5，p8 to to he ．by ．．p8 ． 7 by 905 by 905()he of 905一粘类芽胞杆菌(．1为 本实验分离自小麦根部的内生细菌，前期研究发现， 其基因组中溶血素基因和葡聚糖酶基因有高量表 达，推测该菌株强启动子片段资源丰富，可利用其进 0．3969~．67401O．04．026 基金项目：本研究由国家科技支撑计划(助 收稿日期：2009．03．12 接受日期：2009．05—12 行外源基因的超量表达。

发光标记系统等现代基因 标记技术的兴起，为探明拮抗细菌的根围定殖动态提 供了有效的研究手段绿色荧光蛋白记系统具有标记基因小 多粘类芽胞杆菌菌株．1 (约1 荧光特性稳定(et 2002)、检测 极为方便、核 和真核细胞都能表达、对细胞没有毒性、不会扰乱受 体细胞的正常功能、可原位观测等优点(罗启仕等． 2004)，已被成功用于微生物定殖、对宿主组织侵染、 微生物动态监测、基因表达调控等研究(曹清玉等， 2001)由于植物体自身会产生荧光，对生防细菌在 植物根部定殖的显微观察造成了一定的干扰利用 启动子筛选方法，得到活性强的启动子，与报告基因 连接，以获得标记菌株 荧光强度较大，减少背景对标记菌株的干扰 本研究通过启动子探针载体多粘类 芽胞杆菌基因组中克隆强启动子活性片段，并将多 粘类芽胞杆菌强启动子与绿色荧光蛋白标记基因融 合．构建适合芽胞杆菌的高效表达系统，以获得荧光 表型较好的芽胞杆菌(905工程菌， 有助于进行生防细菌的定殖研究 1结果与分析 子，对转化子进行荧光观察，在激光共聚焦显微镜 (能观察到菌体有明显的荧光其中转化 转化较弱(图4) 1．5质粒遗传稳定性测定 将菌株905和稀释培养，每隔5 验结果表明：在该 条件下其遗传稳定性分别为98．5％、97．7％和96．5％ (图5)。

芽孢杆菌在实验室适宜条件下大约20 裂一代，而其在自然条件下分裂一代所需时间为 50～100 h(et 1999)，因此可以推断新构建 的基因工程菌能够满足作物特定生育期甚至一年生 作物全生育期研究的需要 1．1启动子活性片段的筛选 将连接产物热击转化E．含1O ~g／g／氯霉素抗性的转化子，随机选取转多个化子，通过 提质粒并酶切鉴定证实这些转化子的质粒都含有 100～2 500 中p5、定结果如图1 1．2绿色荧光蛋白表达载体的构建 将绿色荧光蛋白表达载体热激转化E．到的转化子提质粒酶切验证，转化子的质 粒00 外源片段，载体大小约为5．62) 1．3绿色荧光蛋白表达载体在E．建好的3个 表达载体热击转化至E．于四环素抗性平板上，得到转化子，对转化 子进行荧光观察，在激光共聚焦显微镜(能 观察到菌体有明显的荧光其中转化光较强(图3) 1．4标记菌株的荧光观察 构建好的3个905中．涂于四环素抗性平板上，得到转化 图1质粒p5、：、8、17：分别为质粒p5、p8、酶切的产物 l of p5，p8 M：，8，17： of p5，p8 5 8 17 02转化子质粒酶切鉴定图 M：、8、17：分别为转化子质粒R 物 7 M：，8，1 7： of A B 图3标记菌株中的绿色荧光 ．：E．：E．)8；C：E． B 同4标记菌株中的绿色荧’匕 ：： — 一 f f—’0一 J+ √ 95} 94 L————。

———— ———— ———— ———— ———— ———— ——————————一 5 5 2O 25 3O 35 40 45 5O t／h 图5标记菌株的质粒稳定性测定 on of ．6标记菌株与野生菌株生长曲线的测定 将野生型菌株与标记菌株接种于培养基中．每 隔30 制生长曲线(图6)，结合 数据相关性分析，可知野生型菌株与标记菌株生长 基本一致，初步推测外源基因的导入并未对菌株的 生理代谢造成很大影响 2讨论 利用绿色荧光蛋白标记系统可研究微生物与环 网6 q!长曲线 905 905：Y=1．0089x+0．0037．R =0．9993； ：Y=0．9841034，R =0．9981： 7：Y=1．0001123．R =0．9993 蘑 境、宿主的相互作用以及基因表达渊。