分子生物学实验流程.doc

质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定 第一节 概 述 把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子, 大小从 1-200kb 不等,为双链、闭环的 DNA 分子, 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 ,并表达所携带的遗传信息质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等F 质粒( 又称 F 因子或性质粒)、R 质粒( 抗药性因子)和 Col 质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时, 它也不能复制, 通常每个细胞内只含有 1 个或几个质粒分子 ,如 F 因子。

后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝, 一般在 20 个以上,如 Col E1 质粒在使用蛋白质合成抑制剂 -氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA 复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来 20 多个扩增至 1000-3000 个,此时质粒 DNA 占总 DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时 ,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中, 一种质粒占优势, 而在另一些细胞中另一种质粒却占上风当细胞生长几代后, 占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素, 降解复杂有机物, 产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列, 并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。

大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链 DNA、体外转录外源 DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源 DNA 片段；（4）具有容易操作的检测表型常用的质粒载体大小一般在 1kb 至 10kb 之间，如 PBR322、PUC 系列、PGEM 系列和pBluescript（简称 pBS）等从细菌中分离质粒 DNA 的方法都包括 3 个基本步骤: 培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒 DNA采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和 Triton X-100 可使细胞膜裂解经溶菌酶和 SDS 或 Triton X-100 处理后,细菌染色体 DNA 会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体 DNA 比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体 DNA 变性, 而共价闭合环状 DNA(Covalently closed circular DNA，简称 cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体 DNA 片段难以复性, 而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起, 而质粒 DNA 双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子, 并以溶解状态存在于液相中。

在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在在提取质粒过程中，除了超螺旋 DNA 外，还会产生其它形式的质粒 DNA如果质粒DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂, 分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子 ,称开环 DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒 DNA 的两条链在同一处断裂, 则形成线状 DNA(Linear DNA)当提取的质粒 DNA 电泳时, 同一质粒 DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快 第二节 材料、设备及试剂 一、材料 含 pBS 的 E. coli DH5α 或 JM 系列菌株 ，1.5ml 塑料离心管( 又称 eppendorf 管),离心管架 二、设备 微量取液器(20μl,200μl,1000 μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅) ， 涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等三、试剂 1、 LB 液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨 (Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于 800ml 去离子水中，用 NaOH 调 pH 至 7.5, 加去离子水至总体积 1 升, 高压下蒸气灭菌 20 分钟。

2、LB 固体培养基：液体培养基中每升加 12g 琼脂粉,高压灭菌 3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml 水溶液, -20℃保存备用 4、 溶菌酶溶液： 用 10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成 10mg/ml,并分装成小份(如 1.5ml)保存于-20℃, 每一小份一经使用后便予丢弃5、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml 水中溶解 40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸调 pH 至 5.2, 加水定容至 100ml, 分装后高压灭菌, 储存于 4℃冰箱 6、 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶 100ml,高压灭菌 15 分钟 ,储存于 4℃冰箱7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用 10mol/L NaOH 母液稀释) ，1％ SDS 8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至 100ml, 并高压灭菌溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。

9、RNA 酶 A 母液：将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成 10mg/ml 的溶液,于 100℃加热 15 分钟,使混有的 DNA 酶失活冷却后用 1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于-20 ℃ 10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物, 这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致 RNA 和 DNA 的交联, 应在 160℃用冷凝管进行重蒸重蒸酚加入 0.1％的 8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的 0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和 0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其 pH 值达到 7.6 以上, 因为酸性条件下 DNA 会分配于有机相 　　11、 氯仿:按氯仿: 异戊醇＝24:1 体积比加入异戊醇氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫　　按体积/体积＝1:1 混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套 12、 TE 缓冲液： 10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。

高压灭菌后储存于 4℃冰箱中13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-10014、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0) 15、 电泳所用试剂： （1） TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸 27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至1000ml （2）上样缓冲液 (6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液 第三节 操作步骤 一、 细菌的培养和收集 将含有质粒 pBS 的 DH5α 菌种接种在 LB 固体培养基( 含 50μg/ml Amp)中, 37℃培养 12-24 小时用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含 50μg/ml Amp)中,37 ℃振荡培养约 12 小时至对数生长后期 二、 质粒 DNA 少量快速提取 质粒 DNA 小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒 DNA 十分有用。

这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得 DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要一）、煮沸法 1、将 1.5ml 培养液倒入 eppendorf 管中,4℃下 12000ｇ离心 30 秒 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽 3、将菌体沉淀悬浮于 120ml STET 溶液中 , 涡旋混匀 4、加入 10ml 新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡 3 秒钟5、将 eppendorf 管放入沸水浴中,50 秒后立即取出 6、用微量离心机 4℃下 12000g 离心 10 分钟7、用无菌牙签从 eppendorf 管中去除细菌碎片 8、取 20ml 进行电泳检查　　[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒 DNA2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度, 浓度高时 ,细菌裂解效果反而不好有时不同溶菌酶也能溶菌 　　3. 提取的质粒 DNA 中会含有 RNA,但 RNA 并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化 ,亚克隆及连接反应等二）、 碱法 1、取 1.5ml 培养液倒入 1.5ml eppendorf 管中,4 ℃下 12000g 离心 30 秒。

2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽 3、菌体沉淀重悬浮于 100μl 溶液Ⅰ中 (需剧烈振荡),室温下放置 5-10 分钟 4、加入新配制的溶液Ⅱ200 μl, 盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf 管数次, 以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴 5 分钟 5、加入 150μl 预冷的溶液 Ⅲ, 盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡 10 秒,使沉淀混匀, 冰浴中 5-10 分钟,4℃下 12000g 离心 5-10 分钟 6、上清液移入干净 eppendorf 管中,加入等体积的酚 /氯仿(1:1), 振荡混匀,4℃下 12000g 离心 5 分钟 7、将水相移入干净 eppendorf 管中,加入 2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中 20 分钟，然后 4℃下 12000g 离心 10分钟 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入 1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下 12000g 离心 5-10 分钟 9、吸除上清液,将管倒置于。