实验十 pUC57 T载体的制备.docx

实验十 pUC57 T 载体的制备．原理PCR 产物的克隆是一种有效的克隆目的基因的方法，但是在实际应用中，由于方法学上 的一些技术问题可能限制其应用由于PCR产物3'末端突出一个A,因此克隆PCR产物的 载体3'末端必须突出一个T,这样载体与PCR产物之间形成粘性长端现在许多公司开发 出了此类专用于PCR产物克隆的T载体本实验中将平端内切酶EcoRv酶解的EcoRv，用 Taq酶将其3'末端加上T,然后用T4连接酶将能自身环化的质粒连接用凝胶电泳将自身 环化的质粒与3'末端带有T.不能自身环化的线性质粒分开，回收线性质粒片段即为pUC57 T 载体二.方法1. 制备pUC57质粒DNA见实验一)2. 用EcoR V酶解pUC57 DNA见实验九)3. 在酶解的pUC57 DNA末端加上T 取一支0.5ml微离心管.加入：EcoR V 酶解的 pUC57 DNA 10p g10 X PCR 缓冲液 15p ldTTP 10mmol / L 20p lTaq DNA 聚合酶(5U/p l) 1p lddHO to 150|j l 10 000r/min 离心 5s 混匀，72°C水浴 2h。

4. DNA片段的纯化(1) 在上述0.5ml微离心管中加入等体积(15p l)酚/氯仿混匀，放置数分钟，5 000r/min 离心5min.使液体分层2) 吸收酚/氯仿抽捉提之水相至另一 1.5ml离心管中，加入1/10体积的乙酸钠，加2 倍体积冷无水乙醇，混匀20C冰箱放置2h， 15 000r / min离心15min3) 倾去乙醇，加入 70％冷乙醇淋洗4) 倾去乙醇，滤纸吸干，真空抽吸2〜3min5) 加人 30p l ddH2O,溶解 DNA5. 载体DNA自身连接2在DNA片段纯化管中，加入5p l 10x连接酶缓冲液和2UT4 DNA连接酶，并用重蒸水补至总 体积50p l16C连接16小时6. 琼脂糖凝胶电泳将DNA连接液在l%(Wt / V01)琼脂糖凝胶上电泳分离pUC57 T载体和原载体7. pUC57 T 载体的纯化用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化线性载体，井用电泳对此载体进行定量1. 10mmol/ L dTTP2. Taq DNA 聚合酶，5U/p l3. 酚/氯仿4. 乙醇.放置-20C冰箱保存备用5. 乙酸钠，6. 70％冷乙醇7. ddHO8．琼脂糖。

9．T4DNA 连接酶10．10X 连接酶缓冲液 11．溴酚蓝指示剂12．EB 溶液13•琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒四．说明本实验是一个典型的将具有平齐末端的线性DNA片段变成粘性片段的方法在基因工程 过程中.经常要将平齐末端转变为粘性末端或要将粘性末端转变为平齐末端，除了本实验中 的方法外.还有下列方法：1. 在平齐末端产生新限制性内切酶位点的方法(1) 试剂① T4 DNA连接酶② 10xT4 DNA连接酶反应缓冲液300 mmol／L Tris-HCI， pH7.8100 mmol／L MgCl100 mmol／L DTT10 mmol／L ATP注：10X连接酶缓冲液应-20°C保存不要多次冻存和融化连接缓冲液中ATP降解连接 反应失败的最常见原因③ 磷酸化限制酶接头④ 无核酸酶重蒸水⑤ 限制性内切酶及其缓冲液⑥ 氯仿：异戊醇(24： 1)TE缓冲液10 mmol／L Tris—HCIl mmol／L EDTA 酚：氯仿：异戊醇(25： 24： 1) 混合等体积的TE缓冲液与重蒸酚，分层后，再将1份下层酚相与1份氯仿：异戊醇(24： 1) 混合即可2) 原理限制酶接头是合成的DNA双链，含有限制性内切酶识别序列，可用于将一个新的限制 性内切酶位点加入到含平端的DNA片段上。

商品化的接头有5'末端磷酸化和非磷酸化两种 磷酸化的接头更适于本实验.因为T4 DNA连接酶需要一个DNA模板5'末端含磷酸基团使 用磷酸化的接头可以与非磷酸化的载体连接，这样可以降低载体自身重新连接的背景3) 方法① 取一微离心管，分别加入：10 X T4 DNA连接酶反应缓冲液 1|J lDNA(100—500ng) 1p l磷酸化限制酶接头 超过DNA片段的摩尔数100倍・T4 DNA 连接酶(Weiss 单位) 2.5 u加无核酸酶蒸馏水至 lO|J l*注：1p g lkb DNA片段约为1. 52pmol.商品限制酶接头常以A 度量对于10碱基的260限制酶接头，0.015A的量相当于大约152pmol DNA260② 15°C反应6〜18小时③ 70C加热10分钟终止反应④ 立即在冰上冷却反应管，用相应的限制性内切酶进行酶解，⑤ 酶解后，加等体积酚：氯仿：异戊醇(25： 24： 1 )到反应管中提取DNA，振摇l分钟， 12 000g 离心 5 分钟⑥ 转移上层水相至另一新离心管中.为增加回收率，有机相用小量TE缓冲液重提一次⑦ 加等体积氯仿；异戊醇(2J1： 1),振摇30秒，12 OOOg离心2min，移上层水相至另 新管中。

⑧ 用琼脂糖凝胶电泳除掉未连接的限制酶接头片段，从胶中川收DNA片段2. 将 5'突出末端转变为平端的方法(1) 试剂 '① 无核酸酶重蒸水② 限制性内切酶及其缓冲液③ 氯仿：异戊醇(2/1： 1)④ TE缓冲液10 mmol／L Tris-HCll mmol/ L EDTA⑤ 酚：氯仿；异戊醉(24:1)⑥ 3mol/L乙酸钠，pH5. 2⑦ 无水乙醇⑧ 70%乙醇⑨ DNA聚合酶大片段(Klenow)⑩ 10XDNA聚合酶Klenow片段缓冲液500 mmol/ L Tris—HCl， pH7. 2100 mmol/ L MgSO4l mmol/L DTF(11) T4 DNA聚合酶(12) 10 x T4 DNA聚合酶缓冲液330 mmol / L Tris—乙酸 pH 7.9660 mmol/ L 乙酸钾100 mmol/ L 乙酸镁5 mmol/ L DDT(13) 乙酰化牛血清白蛋白，1 mg / ml(14) dNTPs. 100 mmol / L(2) 原理 Klenow(DNA 聚合酶大片段)及 T4 DNA 聚合酶都能利用 dNTPs 补齐 5'突出末端(3) Klenow聚合酶法① 酶解DNA.形成5'突出末端。

② 加等体积酚：氯仿：异戊醇(25： 24： 1 )到反应管中提取DNA,振摇1分钟，12 000g 离心 5 分钟③ 转移上层水相至另一新离心管中，为增加回收率，有机相用小量TE缓冲液重提一次④ 加0.1体积3mol / L乙酸钠和2体积无水乙醇，冰上或-20C放置15〜30分钟，沉淀DNA⑤ 4°C 12 OOOg离心10分钟.如果DNA浓度较低，小于100ng/ml，离心时间为30分钟 这样可增加DNA的回收率注：小量DNA的回收也可通过加入核酸如酵母DNA到样品中，使其终浓度达50p g/ml, 而改进回收效果如果tRNA会影响以后DNA的应用，也可使用糖原⑥ 离心弃上清.加200p l 70%乙醇12 OOOg 4C离心5分钟⑦ 小心移去上清，空气中干燥沉淀⑧ 用含：40p mol / L每种dNTP及0.1mg/ml乙酰化牛血清白蛋的l倍Klenow酶缓冲液 溶解DNA.每微克DNA加入1u lqenowDNA聚合酶总反应体积在10 一 100之间均可Klcnow DNA 聚合酶在许多限制酶反应缓冲液中(如 Promemt 的核心缓冲液)有一定活性 这样可直接将酶及40p mol/L每种dNTP加入到限制酶反应后的反应管中，省略以上的①〜 ⑦步。

将反应管置室温中反应10分钟⑨ 75C作用10分钟终止反应2)T4DNA聚合酶法① 采用Klenow聚合酶法的①一⑦步骤纯化DNA② 用含100p mol/L每种dNTP和0.1mg/ml乙酰化牛血清白蛋白的1倍T4DNA聚合酶 反应缓冲液溶解DNA每微克DNA加5u T4DNA聚合酶② 75C作用10分钟终止反应3•将3'突出末端转变为平端的方法(1) 试剂① 无核酸酶重蒸水② 限制性内切酶及其缓冲液③ 氯仿：异戊醇(24： 1)④ TE缓冲液lO mmol/ L Tris—HCIl mmol/ L EDTA⑤ 酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)⑥ 3mol/L乙酸钠，pH5. 2⑦ 无水乙醇⑧ 70%乙醇⑨ T4 DNA聚合酶⑩ 10 x T4 DNA聚合酶缓冲液330 mmol / L Tris—乙酸，pH 7. 9660 mmol/ L 乙酸钾100mmol/ L 乙酸镁1 mmol/ L DTT(11) 乙酰化牛血清白蛋白(12) dNTPs, 100 mmol / L(2) 原理在过量dNTP存在下T4 DNA聚合酶具有3' 一 5,核酸外切酶活性，能将3,突出末端转变为 平齐末端。

3) 方法① 酶解DNA，形成3'突出末端② 加等体积酚：氯仿：异戊醇(25： 24： 1 )到反应管中提取DNA,振摇1分钟，12 000g离心5 分钟③ 转移上层水相至另一新离心管中，为增加回收率，有机相用小量TE缓冲液重提一次④ 加0.1体积3mol / L乙酸钠和2体积无水乙醇，冰上或-20°C放置15〜30分钟，沉淀 DNA⑤ 4C 12 000g离心10分钟，如果DNA浓度较低，小于100ng/m1，离心时间为30分钟， 这样可增加DNA的回收率注：小量DNA的回收也可通过加入核酸如酵母DNA到样品中，使其终浓度达50p g / ml 而改进回收效果如果tRNA会影响以后DNA的应用，也可使用糖原⑥ 离心弃上清，加200》1 70%乙醇，12 000g 4C离心5分钟⑦ 小心移去上清，空气中干燥沉淀⑧ 用含100p mol/L,每种dNTP及0.1mg / ml乙酰化牛血清白蛋白的1倍T4DNA聚合酶缓冲 液溶解DNA0.2〜5p gDNA的反应体积为20p 1,每微克DNA加5u T4DNA聚合酶37C 反应 5 分钟注：高浓度的dNTPs(100|J mol / L)将使DNA的降解终止在双链DNA处，。

然而，如果 dNTPs含量太低，TIDNA聚合酶的外切酶活性则很高.可使双链DNA降解在本反应中，所 有4种dNTP都必须有⑨ 75 C作用10分钟，终止反应：4. 部分补齐 5，突出末端的方法对上文介绍的“将 5,突出末端转变为平端的方法”进行改进.也可部分补齐 5，突出末端 操作步骤与该方法完全相同只要采用含某一种或某几种碱性dNTP代替含4种dNTP的碱基 即可如Xba I产生的5,突山末端为：“5' - CTAG- 3'，如果dNTP变为dCTP，则可将其 突出末端转变为“ 5'-CTA— 3'如果dNTP中仅含dCTP和dTTP，则突出末端可转变为。