第二节免疫学诊断方法PPT课件.ppt

第二节免疫学诊断方法 已报道的寄生虫免疫学诊断方法很多，包括变态反应、沉淀反应、凝集反应、补体结合试验，免疫荧光抗体技术、免疫酶技术、放射免疫分析技术、免疫印迹技术等此处仅介绍主要几种一、间接血凝试验1.基本原理 间接血凝试验(Indirect heamagglutination assay， IHA)是凝集试验的一种抗原与相应抗体结合形成复合物，在电解质存在下，复合物相互凝集形成肉眼可见的凝集小块或沉淀物根据是否产生凝集现象来判定相应抗原或抗体，称为凝集试验颗粒性抗原与抗体直接结合后出现的凝集现象，称直接凝集试验将可溶性抗原或抗体先吸附于一种与免疫无关的，一定大小的载体颗粒表面，然后与相应抗体或抗原作用，在适宜的条件下由于抗原抗体的特异性结合，会带动载体颗粒的凝集，出现肉眼可见的凝集现象，称间接凝集试验常用的载体颗粒有红细胞（“O”型人红细胞，羊红细胞），聚苯乙烯胶乳颗粒，白陶土，离子交换树脂，火棉胶等以红细胞为载体时，就称作间接血凝试验2.间接血凝试验的种类Ø间接血凝试验(IHA) 先将抗原吸附于红细胞表面，以检测标本中的抗体将抗原或抗体吸附于红细胞表面的过程，称致敏。

吸附有抗原或抗体的红细胞称致敏红细胞Ø反向间接凝试验(RIHA) 用特异性抗体致敏红细胞，以检测标本中的抗原Ø间接血凝抑制试验(IHAI) 该试验用抗原致敏的红细胞来检测相应的抗原方法是先在被检样本中加入相应抗体，作用一段时间后再加入致敏红细胞如标本中含有相应的抗原，则抗原将先与抗体结合，再加入抗原致敏的红细胞后则不出现凝集若标本中不存在抗原，则出现凝集Ø反向间接血凝抑制试验 (RIHAI) 该试验用抗体致敏的红细胞检测标本中的抗体方法为先在待检样本中加入相应抗原，作用一段时间后再加入致敏红细胞若标本中含有相应抗体，则不出现凝集，若不含抗体，则出现凝集3. 间接血凝技术的优缺点ØIHA已广泛用于寄生虫病 的诊断和流行病学调查， 有较高的敏感性和一定的 特异性，如对日本血吸虫 病的诊断，阳性检出率可 达91.9~100%，假阳性为 0.7~3.2%Ø致敏红细胞冷冻干燥后， 在4℃可保存1~2年，所 用器材简单，国内均已 生产且方法简便快速， 便于基层单位使用Ø缺点是不同实验室制备的 红细胞和不同批号制品， 其敏感性和特异性可能不 一致，因此试剂制品需标 准化和商品化。

另外还存 在一定的非特异性反应， 这与致敏红细胞的质量优 劣有关必要时可用血凝 抑制试验来排除非特异性 反应二、免疫荧光技术免疫荧光技术(Immunofluorescence method)又称荧光抗体标记技术(Fluorescent-labelled antibooly technique)，是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法1.荧光色素Ø某些物质在光的照射下 吸收光能进入激发状态， 而从原来的激发状态回 到原来的基态时，能够 从电磁辐射形式放射出 所吸收的光能，这种现 象叫光致发光在光致发光现象中，如果用一波长较短的光(如紫外光)照射某种物质时，这种物质在极短的时间内能发射出波长较照射光波长为长的光(如可见光)，这种光称荧光能产生荧光的物质称为荧光色素或荧光素荧光色素种类很多用于标记抗体的荧光色素必须具有下列条件①能与免疫球蛋白共价结合， 结合物稳定②结合后不影响免疫球蛋白 免疫活性，同时荧光效率 无明显影响③标记方法简单、迅速、安 全无毒目前最常用的荧光色素有以下三种l异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate， FITC)为黄色结晶形粉末，分子量为389，呈明亮的黄绿色荧光，是最常用的一种l四乙基罗丹明(lissamine rhodamine B200， RB200)为褐红色粉末， 呈明亮的橙色荧光。

本品为碘酸钠盐(-SO3Na)，不能直接与蛋白质结合，需在五氯化磷作用下转化为碘氯(-SO2Cl)才能与蛋白质结合l四甲基异硫氰基罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC)为紫红色粉末， 荧光呈橙红色，与FITC的荧光对比清晰，且其本身含有异硫氰基(NCS)，易与蛋白质结合，比RB200使用方便，近年来已较多地应用于双标记工作Ø观察时，首先点燃高压汞 灯5~10分钟后调节暗视野， 观察标本每次观察时间 不宜超过 2小时，否则影 响高压汞灯的寿命，并且 发光强度减弱Ø判定结果时，一一为无荧光， 二为极弱的可疑荧光，+荧 光弱但清楚可见，++荧光 明亮，+++~++++荧光强而 明亮目前使用的荧光显微镜一般均带有自动摄影装置需摄影时，由于荧光摄影时间长，故应用快速感光胶卷，以24~29DIN为宜Ø目前，荧光免疫技术已 在许多寄生虫病中得到 应用如血吸虫病、锥 虫病、旋毛虫病、弓形 虫病、利什曼病等三、免疫酶技术1.基本原理Ø免疫酶技术是继免疫荧光 技术之后发展起来的又一 种免疫标记技术，是根据 抗原与抗体特异性结合， 以酶作标记物，酶对底物 具有高效催化作用的原理 而建立的。

酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性酶标抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合后，形成酶标抗体—抗原复合物复合物中的酶在遇到相应的底物时，催化底物分解，使供氢体氧化而生成有色物质有色物质的出现，客观地反映了酶的存在根据有色产物的有无及其浓度，即可间接推测被检抗原或抗体是否存在以及其数量，从而达到定性或定量的目的Ø免疫酶技术在方法上分为 两类，一类用于组织细胞 中的抗原或抗体成分检测 和定位，称为免疫酶组织 化学或免疫酶染色法，另 一类用于检测液体中可溶 性抗原或抗体成分，称为 免疫酶测定法Ø免疫酶染色法是标本制备 后，先将内源酶抑制，然 后进行免疫酶染色检查 其基本原理和方法与荧光 抗体法相同，只是以酶代 替荧光素作为标记物，并 以底物产生有色产物为标 志常规免疫酶染色法可 分为直接和间接两种方法l真接法 是用酶标记特异性抗体，直接检测寄生虫或其抗原在含有寄生虫或其抗原的标本固定后，消除其中的内源性酶，用酶标记的抗体直接处理，使标本中的抗原与酶标抗体结合，然后加底物显色，进行镜检l间接法 是将含有寄生虫或其抗原的组织或细胞标本，用特异性抗体处理，使抗原抗体结合，洗涤清除未结合的部分，再用酶标记的抗抗体进行处理，使其形成抗原—抗体—酶标记抗抗体复合物，最后滴加底物显色，进行镜检间接法虽然多一步骤，但比直接法特异性强，使用范围广。

酶标记第二抗体可用葡萄球菌A蛋白SPA或生物素与亲合素系统等代替，亦成功地用于许多抗原和抗体的检测同时，在不同程度上提高了检测方法的特异性与敏感性Ø免疫酶测定法分固相免 疫酶测定法和均相免疫 酶测定法两类l固相免疫酶测定法 是需用固相载体，以化学的或物理的方法将抗原或抗体连接其上，制成免疫吸附剂，随后进行免疫酶测定酶联免疫吸附试验(ELISA)是固相免疫酶测定法中应用最广泛的一种l均相免疫测定法 不需将游离的和结合的酶标记物分离，也不需载体，直接从溶液中测定结果本法主要用于激素、抗生素等小分子半抗原的检测 2.用于标记的酶及其底物 应用较多的有辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和β半乳糖苷酶等，其中以辣根过氧化物酶应用最广3.酶标抗体Ø酶标抗体可直接购自生物 试剂公司，亦可实验室标 记抗体的酶标记中，酶 的活性和纯度至关重要 抗体也要求纯化程度高， 最好用亲和层析纯化，但 在单抗标记中也可直接标 记小鼠的腹水理想的结合剂应具备生产率高，结合物稳定，不影响酶的活性和抗体的活性，不产生干扰物质、操作简便等条件。

目前主要采用戊二醛标记法和过碘酸钠标记法Ø戊二醛标记法的原理是通 过它的醛基与免疫球蛋白 上的氨基共价结合，即戊 二醛上的两个活性醛基， 一个与酶分子上的氨基结 合，另一个与免疫示蛋白 上氨基结合，形成一个酶 —戊二醛—免疫球蛋白结 合物标记过程可参见有 关免疫学书籍Ø过碘酸钠法主要用于HRP 的标记优点是标记率高， 未标记的抗体量少，但结 合物分子量较大，穿透细 胞的能力不如用戊二醛法 标记的抗体，故不适于在 免疫电镜中应用标记过 程可参见有关免疫学书籍4.免疫酶染色法Ø以间接法为例 抗原底片的制备同免疫荧光技术不同的是哺乳动物的某些组织中常存在内源性过氧化物酶，对试验结果造成干扰因此，实验前需进行阻断方法是将抗原底片置0.5~2%H2O2—PBS中处理30分钟，再用PBS冲去H2O2后干燥即可底片上加入待检血清血清中特异性抗体与抗原底片中抗原结合待检血清可作系列稀释，亦可通过预试验决定其最适稀释度血清应完全覆盖抗原切片，并置湿盒中37℃保温30min，以保证抗体与抗原的充分结合洗涤底片用pH7.4 0.05mol/L Tris—HCl洗涤液洗涤5min，共3次，空气干燥，加入酶标记抗体。

一般采用HRP标记的抗抗体酶结合物工作浓度可通过预试验确定切片置湿盒中37℃保温30min此外，酶结合物的浓度一般不宜过高，并应充分洗涤再次洗涤，加入底物用于免疫酶染色的底物为3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐溶液(DAB)其配方为：3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐40mg，溶于0.05mol/L pH 7.4 Tris—HCl缓冲液50ml中，置棕色瓶中充分搅拌，4℃保存用前应过滤，滤液中每10ml加入0.3% H2O20.1ml抗原底片置底物溶液中，37℃保温15min用0.05mol/L pH 7.4 Tris—HCl缓冲液洗涤30min，空气干燥后置普通显微镜下观察寄生虫虫体呈现棕色者为阳性反应为方便抗原定位，在酶免疫酶反应之后还可以将切片复染，以确定抗原在细胞组织中的位置但应注意复染不可过深，以免遮盖酶免疫染色Ø免疫酶染色可以用于检测 抗原和抗体若抗原底片 中的抗原为已知，则可测 被检血清中的抗体若有 已知的抗体，则可检测抗 原底片中的寄生虫抗原5.酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 其基本过程是将抗原(或抗体)吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。

现以弓形虫为例加以介绍Ø抗原制备同IHA所需主 要器材有微量反应板、酶 标仪洗液为0.05%吐温 —20 PBS，pH 7.4，含 0.02%NaN3　被检血清 稀释液为上述洗液加1% 牛血清蛋白被检血清经 56℃30min灭活底物为磷酸-枸橼酸缓冲液100ml，邻苯二胺40mg，30%过氧化氢0.15ml所组成兔抗人或猪IgG辣根过氧化物酶结合物羊抗人或猪IgG辣根过氧化物酶结合物包被抗原用0.1mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释为10μg/ml,加入微量反应板,每孔100μl,置4℃过夜次日用洗液洗3次,每次5min, 甩干每孔加1:400稀释的被检血清100μl,37℃湿盒孵育2h,同上法洗涤每块板均有空白(未包被抗原)、PBS、阴性及阳性对照孔每孔加兔抗人或猪IgG酶结合物100μl孵育及洗涤方法同上每孔加底物100μl室温暗处放置15min后，每孔加入4mol/L H2SO4 0.025ml终止反应读数：以空白对照孔调零点，在微量板阅读仪上读取光密度值，波长490nm，计算P/N比值P/N=(A490标本－A490PBS对照)/( A490阴性对照血清－A490PBS对照)公式中P代表待检血清，N为阴性对照血清，A490为在490nm时的光密度值ØP/N大于2者，判为阴性。

定量结果以终点滴度表 示将血清稀释，出现 阳性的最高稀释度为该 血清的ELISA滴度Ø近年来，在ELISA的基础 上，又创建了一些新的酶 免疫测定法不下10余种 其中主要的有：①金葡菌A蛋白 (Staphylococcal protein A, SPA)—ELISA 用辣根过氧化物酶标记SPA，取代酶标第2抗体②亲和素—生物素(biotin— avidin., ABC)—ELISA 系将亲和素—生物素和SPA同时引入免疫酶技术，用生物素标记SPA，用辣根过氧化物酶标记亲和素而建立的一种新的酶免商技术本法可检测抗体，也可检测抗原，测出抗原的下限为4ng/ml，比常规ELISA的30~50ng/ml更为灵敏③斑点(Dot)—ELISA 将微量抗原点于硝酸纤维素膜圆片上，置平板微量滴定板凹孔底部进行ELISA检测可检测IgM与IgG抗体此法可以目测，2h即能完成反应,抗原玻片保存于—20℃270天仍具有抗原性本法价廉，适用于现场应用④单克隆抗体 (monoclonal antibody, McAb)—ELISA。