9抗菌药物敏感性试验与耐药检测ppt生物技术实验教学中心.ppt

实验九实验九 抗菌药物敏感性试验与耐药检测抗菌药物敏感性试验与耐药检测一、实验目的：一、实验目的：一、实验目的：一、实验目的：1. 1. 掌握纸片扩散法（掌握纸片扩散法（K-BK-B法）的原理、操作方法、法）的原理、操作方法、结果的判读及临床意义结果的判读及临床意义2. 2. 了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作方法、结果判读和临床意义方法、结果判读和临床意义3. 3. 掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量控制二、实验原理二、实验原理 1. 抗菌药物敏感性试验是测定抗生素或其他抗微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力这种能力可以通过稀释或扩散方法来测定 1）稀释法敏感性试验 为了定量测定抗菌药物的活性，抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合进行稀释，然后种入试验细菌，孵育过夜，能抑制细菌生长的最低浓度称为该制剂的最低抑菌浓度(MIC) ，然后将MIC 与机体血清或体液中可获得药物浓度相比较，来确定恰当的临床疗效2）纸片扩散法敏感性试验 将含有一定量抗菌药物的纸片贴在已接种试验菌的琼脂平板上，通过纸片上抗生素的扩散形成不同的药物浓度梯度，在距离纸片一定距离的范围内试验菌的生长受到抑制。

这种抑制作用与细菌的敏感性及其他因素相关 2.抗菌药物敏感性试验目的：1）指导临床医师对各类患者选择最佳抗菌药物2）在一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐药的微生物流行病学资料3.抗菌药物：抗菌药物： 一一一一般般般般指指指指具具具具有有有有杀杀杀杀菌菌菌菌或或或或抑抑抑抑菌菌菌菌活活活活性性性性的的的的药药药药物物物物，，，，包包包包括括括括各各各各种种种种抗抗抗抗生生生生素素素素、、、、磺磺磺磺胺胺胺胺类类类类、、、、咪咪咪咪唑唑唑唑类类类类、、、、硝硝硝硝基基基基咪咪咪咪唑唑唑唑类类类类、、、、喹喹喹喹诺诺诺诺酮酮酮酮类类类类等化学合成药物等化学合成药物等化学合成药物等化学合成药物 抗生素类包括抗生素类包括抗生素类包括抗生素类包括: : β-β-内内内内酰酰酰酰胺胺胺胺类类类类（（（（青青青青霉霉霉霉素素素素类类类类、、、、头头头头孢孢孢孢菌菌菌菌素素素素类类类类、、、、头头头头霉霉霉霉素素素素类类类类、、、、亚亚亚亚胺胺胺胺硫硫硫硫霉霉霉霉素素素素、、、、单单单单环环环环内内内内酰酰酰酰胺胺胺胺类类类类及及及及β β－－－－内内内内酰酰酰酰胺胺胺胺酶酶酶酶抑抑抑抑制制制制剂剂剂剂））））、、、、氨氨氨氨基基基基糖糖糖糖苷苷苷苷类类类类、、、、大大大大环环环环内内内内酯酯酯酯类类类类、、、、林林林林可可可可霉霉霉霉素素素素类类类类及及及及四四四四环环环环素类等。

素类等β内酰胺类：内酰胺类：抑制细胞壁合成抑制细胞壁合成青霉素类：青霉素类： 青霉素青霉素G、苯唑西林、阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林、阿莫西林、氨苄西林头孢菌素类：头孢菌素类： 头孢拉定等；头孢呋辛头孢拉定等；头孢呋辛 ；头孢他啶；头孢吡肟；头孢他啶；头孢吡肟其他：其他： 亚胺培南、氨曲南、头孢西丁、氨苄西林亚胺培南、氨曲南、头孢西丁、氨苄西林/舒巴坦舒巴坦 氨基糖苷类：氨基糖苷类： 作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌的蛋白质合成作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌的蛋白质合成作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌的蛋白质合成作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌的蛋白质合成的全过程，并破坏细胞膜的完整性主要作用于的全过程，并破坏细胞膜的完整性主要作用于的全过程，并破坏细胞膜的完整性主要作用于的全过程，并破坏细胞膜的完整性主要作用于G-G-杆菌杆菌杆菌杆菌 ，如链霉素、卡那霉素等，如链霉素、卡那霉素等，如链霉素、卡那霉素等，如链霉素、卡那霉素等大环内酯类：大环内酯类： 通通通通过过过过阻阻阻阻断断断断转转转转肽肽肽肽作作作作用用用用和和和和mRNAmRNA位位位位移移移移而而而而抑抑抑抑制制制制细细细细菌菌菌菌蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的合成。

主要作用于球菌，如红霉素、麦迪霉素等合成主要作用于球菌，如红霉素、麦迪霉素等合成主要作用于球菌，如红霉素、麦迪霉素等合成主要作用于球菌，如红霉素、麦迪霉素等喹诺酮类：喹诺酮类： 通通通通过过过过拮拮拮拮抗抗抗抗细细细细菌菌菌菌的的的的DNADNA旋旋旋旋转转转转酶酶酶酶，，，，从从从从而而而而阻阻阻阻断断断断细细细细菌菌菌菌DNADNA的的的的复复复复制制制制而而而而产产产产生生生生快快快快速速速速杀杀杀杀菌菌菌菌作作作作用用用用主主主主要要要要作作作作用用用用于于于于GG- 杆杆杆杆菌菌菌菌，，，，如环丙沙星如环丙沙星如环丙沙星如环丙沙星 、利福平等、利福平等、利福平等、利福平等1）敏感：）敏感： 由被测细菌引起的感染，除禁忌症外，可用该抗菌药物常用推荐剂量通过恰当治疗而达到治疗目的2）中介：）中介： 被测菌株对该药物的MIC 接近于血液、组织中通常可达到的浓度，而治疗反应率可能低于敏感菌株3）耐药：）耐药： 被测菌株不能被该抗生素的常用剂量，在组织内或血液中达到的浓度所抑制，提示该菌可能存在特定耐药机制(如产β-内酰胺酶) ，而且治疗研究表明其临床疗效不可靠。

4.抗菌药物敏感性试验结果判断：原理：原理： 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈无菌生长的透明圈即为抑菌圈 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的并与该药对测试菌的MICMIC呈负相关呈负相关 5.纸片扩散法（纸片扩散法（Kirby-Bauer法）法） （（1 1）分类：）分类： 琼脂稀释法、肉汤稀释法、微量稀释法琼脂稀释法、肉汤稀释法、微量稀释法（（2 2）原理：）原理： 用用水解酪蛋白（水解酪蛋白（MH）培养基）培养基将抗生素作不同浓度的将抗生素作不同浓度的稀释，然后接种待测细菌，定量测定抗菌药物对被测稀释，然后接种待测细菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度（或最低杀菌浓度（MBC）。

6.6.稀释法稀释法 （3）微量液体稀释法微量液体稀释法原理： 聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时每孔加入每孔加入100μl100μl浓度为浓度为10105 5 CFU/ml CFU/ml的菌液，盖上盖板，的菌液，盖上盖板，37℃37℃孵育孵育1616～～20h20h观察结果孔底部清晰不出现细菌沉观察结果孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小淀的最低抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度，通过抑菌浓度，通过CLSICLSI标准判断其敏感和耐药标准判断其敏感和耐药7. E7. E7. E7. E试验试验试验试验 是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量的技术原原原原理理理理：： E E试试条条是是一一条条5mm×50mm5mm×50mm无无孔孔试试剂剂载载体体，，一一面面固固定定有有一一系系列列预预先先制制备备的的浓浓度度呈呈连连续续指指数数增增长长稀稀释释抗抗菌菌药药物物，，另另一一面面有有读读数数和和判判别别的的刻刻度度。

抗抗菌菌药药物物的的梯梯度度可可覆覆盖盖有有2020个个MICMIC对对倍倍稀稀释释浓浓度度的的宽宽度度范范围围将将E E试试条条放放在在细细菌菌接接种种过过的的琼琼脂脂平平板板上上，，经经孵孵育育过过夜夜，，围围绕绕试试条条明明显显可可见见椭椭圆圆形形抑抑菌菌圈圈，，圈圈的的边边缘缘与与试试条条交交点点的的刻刻度度浓浓度度即即为为抗抗菌菌药药物物抑抑制制细细菌菌的的最最小小抑抑菌菌浓浓度度，，对对照照CLSICLSI标准判断其敏感、耐药、中介标准判断其敏感、耐药、中介 8.联合药物敏感试验联合药物敏感试验1）方法很多，其中纸片法最为常用先将试验菌均）方法很多，其中纸片法最为常用先将试验菌均匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分钟，待分钟，待平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板上，两纸片中心距离上，两纸片中心距离2--4mm左右然后左右然后35℃ 孵育孵育过夜，取出观察结果过夜，取出观察结果2）结果判断）结果判断联合药物敏感试验可出现四种结果：联合药物敏感试验可出现四种结果：A.无关作用：无关作用： 甲甲+乙乙=甲单或乙单甲单或乙单B.拮抗作用：拮抗作用： 甲甲+乙＜甲单或乙单乙＜甲单或乙单C.相加作用：相加作用： 甲甲+乙乙=甲单甲单+乙单乙单D.协同作用：协同作用： 甲甲+乙＞甲单乙＞甲单+乙单乙单三、实验操作步骤三、实验操作步骤三、实验操作步骤三、实验操作步骤（一）（一）（一）（一）纸片扩散法：纸片扩散法：1. M-H平板：直径为90mm，厚度 4mm。

2. 菌悬液制备：无菌挑取菌落于无菌生理盐水中，校 正浊度至0.5 麦氏3. 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻 轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方式均匀涂抹琼脂平板表面三次（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周盖上平板的盖子，放置3~10min 4.4.用无菌镊子将抗菌纸片粘贴于用无菌镊子将抗菌纸片粘贴于M-HM-H琼脂的表面，一琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中心距离应大于旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中心距离应大于 24mm24mm，纸片距平板内缘应大于，纸片距平板内缘应大于15mm15mm滤纸直径为（滤纸直径为（滤纸直径为（滤纸直径为6.35mm6.35mm，，，，-20-20℃℃保存，使用前放置室温平衡保存，使用前放置室温平衡保存，使用前放置室温平衡保存，使用前放置室温平衡5. 375. 37℃℃孵育孵育1616～～24h24h6. 6. 量取抑菌环直径，根据量取抑菌环直径，根据CLSICLSI标准，报告细菌对该抗标准，报告细菌对该抗生素敏感生素敏感(S)(S)、耐药、耐药(R)(R)、中介、中介(I)(I)。

（二）液体微量稀释法（二）液体微量稀释法（二）液体微量稀释法（二）液体微量稀释法1.菌液稀释： 将已稀释好的0.5麦氏的待测菌做200倍稀释；2.抗生素稀释： 取无菌离心管11支，每管加入250ul M-H液体培养基，在第1孔内加入浓度为5120ug/ml的抗生素250ul，混匀；吸取250ul此液体至第2孔中，混匀；依次倍比稀释至第11孔.3.每人取无菌聚苯乙烯板条一条，共12孔；第1-11孔每孔加入100ul加抗生素，第12孔加100ulM-H液体，做对照；4.每个孔加入100ul浓度为105菌悬液（大肠或金葡），混匀，胶布封口，37°C培养 5.观察浊度，凡孔底清晰或不出现细菌沉淀的最低药物浓度即为该抗生素对被测菌的最低抑菌浓度（MIC）四、四、四、四、 结果判断及临床意义结果判断及临床意义结果判断及临床意义结果判断及临床意义n n敏感n n中介n n耐药最小抑菌浓度最小抑菌浓度最小抑菌浓度最小抑菌浓度(MIC) (MIC) (MIC) (MIC) ：：：： 可完全抑制细菌增长的最低药物浓度。

可完全抑制细菌增长的最低药物浓度最低杀菌浓度最低杀菌浓度最低杀菌浓度最低杀菌浓度(MBC)(MBC)(MBC)(MBC)：：：： 杀死杀死99.999.9％的供试微生物所需的最低药物浓度％的供试微生物所需的最低药物浓度 如果受试药物对供试微生物的如果受试药物对供试微生物的如果受试药物对供试微生物的如果受试药物对供试微生物的MBCMBCMBCMBC大于或等于大于或等于大于或等于大于或等于32323232倍的倍的倍的倍的MICMICMICMIC，可判，可判，可判，可判定耐药 五、质量控制：五、质量控制：每每批批或或每每次次实实验验时时应应根根据据测测试试菌菌种种类类分分别别选选用用标标准准菌株在同一试验条件下进行测定菌株在同一试验条件下进行测定 如：金黄色葡萄球菌如：金黄色葡萄球菌ATCC25923 大肠埃希菌大肠埃希菌ATCC25922 粪肠球菌粪肠球菌ATCC29212 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌ATCC27853等等六、影响因素：六、影响因素：1. 培养基：培养基：厚度，厚度，PH，离子浓度，成份，添加剂；，离子浓度，成份，添加剂；2. 抗菌药物的配制方法，抗菌药物的配制方法，纸片的含量，大小，纸片的含量，大小， 渗透性，保存方式等；渗透性，保存方式等；3. 细菌的接种量；细菌的接种量；4. 培养的环境，温度与时间；培养的环境，温度与时间；5. 结果的判断及解释标准结果的判断及解释标准等。