实验一血糖的斐林法测定.doc

实验一 血糖的斐林法测定一、实验目的掌握Folin-Wu法测定血糖含量的原理和方法二、实验原理1.血糖指的是血液中哪一种糖？葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测血液中葡萄糖的含量2.用什么方法测定？测定血液中葡萄糖的含量，即测复杂组分中一种物质的量，根据生化实验基本技术的原理，可采用分光光度法（比色法）进行测定3.葡萄糖可以用比色法直接测定吗？不行，可以用间接的方法血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合物的量成正比，可以用比色的方法进行测定三、材料、仪器与试剂（一）、材料：动物血液（二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）分光光度计、血糖管、奥氏吸管、水浴锅、表面皿（三）、药品（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制）标准葡萄糖溶液、碱性硫酸铜溶液（A、B液）、酸性钼酸盐溶液、10％钨酸钠溶液、0.33mol/L硫酸溶液四、实验操作：1.无蛋白血滤液的制备用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血1ml，缓缓放入20ml锥形瓶中，加水7ml，摇匀，血液变成红色透明时加10％钨酸钠1ml， 摇匀，再加 0.33mol /L 硫酸，随加随摇，加完放置5～15min，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸过滤。

每毫升无蛋白血滤液相当于0.1ml全血2.血糖的测定取具25ml刻度的血糖管3只，编号，用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第一只血糖管中，于第二只血糖管中加2ml标准葡萄糖溶液第三只血糖管中加2ml蒸馏水然后各加2ml新配置的碱性硫酸铜溶液，同时置沸水浴内煮6min，取出，在流水中迅速冷却，各加入4ml酸性钼酸盐溶液，1min后以蒸馏水稀释至25ml，混匀，倒入比色杯，用722型风光光度计于420～440nm波长比色（先以空白管调节零点，然后测标准管和样品管）五、计算按下式计算100ml全血中所含的血糖质量（mg）m＝ A1C0A0 / 0.1 x100式中：m：100ml血中所含的糖质量C0：标准葡萄糖溶液浓度A1：样品溶液吸光度A0：标准溶液吸光度六、注意事项1.欲得准确结果，所取血液的量必须准确如果由吸管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内壁，容量不准，所以一般放出1ml血液所用的时间不应少于1min2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作用生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性、沉淀如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨酸与血混合液中加入10％硫酸1～2滴，待变为暗棕色后再滤。

实验二 种子粗脂肪的提取一、实验目的脂肪广泛存在于油料植物种子和果实中，测定脂肪的含量，可以鉴别其品质的优劣，也是油料作物选种和种质资源调查的常规测定项目二、实验原理在了解了实验目的之后，关于这个实验有以下几个问题需要大家思考：1.种子成分很复杂，脂肪的提取如何进行？2.什么是粗脂肪？（答：脂肪不溶于水，易溶于有机溶剂（如石油醚）利用这一特性，选用有机溶剂直接浸提出样品中的脂肪进行测定提取物中除脂肪之外，还有游离脂肪酸、石蜡、磷脂、固醇、色素、有机酸等物质，故浸提物称粗脂肪通过以上问题的思考，我们知道了脂肪的提取主要是利用其易溶于有机溶剂的特性具体的实验操作粗脂肪的提取，一般采用索氏脂肪提取器 利用脂类物质溶于有机溶剂的特性在索氏提取器中用有机溶剂（本实验用石油醚，沸程为 30 ～ 60 ℃）对样品中的脂类物质进行提取 图 索氏脂肪提取器1. 浸提管 2. 通气管 3. 虹吸管 4. 小烧瓶 5. 冷凝管索氏提取器是由提取瓶、提取管、冷凝器三部分组成的，提取管两侧分别有虹吸管和连接管各部分连接处要严密不能漏气提取时，将待测样品包在脱脂滤纸包内，放入提取管内提取瓶内加入石油醚，加热提取瓶，石油醚气化，由连接管上升进入冷凝器，凝成液体滴入提取管内，浸提样品中的脂类物质。

待提取管内石油醚液面达到一定高度，溶有粗脂肪的石油醚经虹吸管流入提取瓶流入提取瓶内的石油醚继续被加热气化、上升、冷凝，滴入提取管内，如此循环往复，直到抽提完全为止三、材料、仪器与试剂（一）实验材料 大豆、花生、蓖麻、向日葵、芝麻等油料种子 （二）仪器设备 索氏提取器（ 50 mL ），烧杯，干燥器，脱脂滤纸，镊子，分析天平，烘箱，恒温水浴，脱脂棉三）试剂 石油醚（化学纯，沸程 30 ～ 60 ℃）四、实验操作 1.将洗净、晾干的芝麻种籽放在 80 ～ 100 ℃烘箱中烘 4 小时待冷却后，准确地称取 2 ～ 4 g ，置于研钵中研磨细，将研碎的样品及擦净研钵的脱脂棉一并用脱脂滤纸包住用丝线扎好，勿让样品漏出或用特制的滤纸斗装样品后，斗口用脱脂棉塞好放入索氏提取器的提取管内，最后再用石油醚洗净研钵后倒入提取管内 2. 洗净索氏提取瓶，在 105 ℃烘箱内烘干至恒重，记录重量将石油醚加到提取瓶内约为瓶容积的 1/2 ～ 2/3 把提取器各部分连接后，接口处不能漏气用 70 ～ 80 ℃恒温水浴加热提取瓶，使抽提进行 16 小时左右，直至抽提管内的石油醚用滤纸检验无油迹为止此时表示提取完全 3. 提取完毕，取出滤纸包，再回馏一次，洗涤提取管。

再继续蒸馏，当提取管中的石油醚液面接近虹吸管口而未流入提取瓶时，倒出石油醚若提取瓶中仍有石油醚，继续蒸馏，直至提取瓶中石油醚完全蒸完取下提取瓶，洗净瓶的外壁，放入 105 ℃烘箱中烘干至恒重，记录重量 五、注意事项1.本法采用沸点低于 60 ℃的有机溶剂，不能提取出样品中结合状态的脂类，故此法又称为游离脂类定量测定法 2.待测样品若是液体，应将一定体积的样品滴在脱脂滤纸上在60～80℃烘箱中烘干后放入提取管内 3.本法使用有机溶剂石油醚（沸程 30 ～ 60 ℃）故加热时不能用明火 六、思考题 1. 索氏提取法提取的为什么是粗脂肪 ? 2. 做好本实验应注意哪些事项 ?实验三 氨基酸分离——双向层析法一、实验目的学习双向纸层析的原理和操作方法，进行混合氨基酸的分离分析二、实验原理纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱样品经展开后其一物质在纸层析谱上的位置常用比移值Rf来表示。

Rf =纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的Rf值，据此可达到分析鉴定的目的由于滤纸纤维可吸收20～25%的水分；且其中6～7%以氢键形式与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶剂作流动相 纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种氨基酸分离一般用上行法上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）双相层析谱可分辨十几种以上的样品层析滤纸要求：（1）质地均匀，平整无折痕，厚薄适当，溶剂能匀速展开2）机械强度好，溶剂展开后能保持原状，不易折到3）有一定纯度而少杂质，以免影响层析图谱背景4）纤维松紧适宜，一般选用中速滤纸，或根据溶剂选择如丁醇类粘度大，宜用快速滤纸；而氯仿、石油醚展开快，宜用慢速滤纸层析溶剂要求：（1）被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.05～0.8之间，各组分之Rf值相差最好能大于0.05，以免斑点重叠。

2）溶剂系统中任一组分与分离物之间不能起化学反应3）分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱图谱示意如下：三、材料、仪器与试剂（一）实验材料 标准氨基酸混合溶液：亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各100mg溶于50ml 0.01M盐酸中 （二）仪器设备 层析缸2540cm（2）；培养皿15cm（2）；喷雾器；毛细管内径0.1cm；电吹风；烘箱层析滤纸1411cm；铅笔，尺三）试剂0.1%（W/V）茚三酮溶丙酮液;溶剂系统：第一相：正丁醇∶88%甲酸∶水＝15∶3∶2（V/V）；第二相：正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水＝5∶1∶1∶1（V/V）四、实验操作1.点样取层析滤纸一张（1411cm），在距纸边1.2cm处划一基线；再将纸转90，距纸边1.2cm处作一线与上线垂直以毛细管吸取混合氨基酸溶液，点与二线交点处（见图4-1），点的直径控制在2mm左右，不可过大待样品干燥后再点一次滤纸上点样斑点干燥后，把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铬丝相连，但不可重叠相碰。

2.展层在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿将圆筒形滤纸放入，点样一段接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准待溶剂自下而上均匀展开，约2小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸，悬挂于室温中，以电吹风充分吹尽溶剂然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘，将滤纸转90，卷成如前圆筒状，放入盛第二相溶剂的层析缸内展开（操作同上），约1小时后溶剂展开到距纸边0.5cm时取出，以电吹风吹尽溶剂使其干燥纸层析点样、展层（X, Y分别为云点至斑点中心和溶剂前沿的距离，x为点样原点）3.显色以喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上，然后悬滤纸于65℃烘箱内加热20分钟，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出五、注意事项（1）烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红2）第一相溶剂最好在使用前再按比例混合，否则会引起酯化影响层析效果3）接触滤纸时，要戴手套六、思考题：1．酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？2．为什么展层时要用两种溶剂系统？实验四 样品中总氮量的测定——微量凯氏定氮法一、实验目的1.掌握凯氏定氮仪的使用方法；2.掌握凯氏定氮法测定样品总氮量的原理二、实验原理1.什么是凯氏定氮法？有什么意义？大多数蛋白质中氮的含量较恒定，平均为16％，即每100g蛋白质中含16g氮，因此可通过测定生物样品中的氮来测定蛋白质的含量（每测得1g氮即相当于6.25g蛋白质）。

这是定氮法测定蛋白质含量的计算基础，即用定氮法测得的样品含氮量乘以6.25，即可算出样品中蛋白质的含量蛋白质含量＝含氮量6.25，测定蛋白质含量的方法很多，其中最基本和常用的方法就是测定含氮量的方法测定含氮量一般都采用微量凯氏定氮法2.该方法原理？蛋白质样品先经浓硫酸加热消化，使蛋白质中的有机氮转变成为无机氮，然后经碱化蒸馏，放出的氨气用标准酸吸收，再用标准碱来滴定剩余的酸，计算出的含氮量乘以6.25即是该样品中的蛋白质含量三、材料、仪器与试剂（一）实验材料：市售面粉（二）仪器设备 （仪器的选。