毒理学描述性动物毒性实验.pdf

第五章 描述性动物毒性实验描述性动物毒性实验是指通过对环境有害因素特别是外源化学物的毒理学 基础研究，包括一定程序的实验动物选择、实验模型的制作、数量与剂量确定、 染毒方法及毒性指标等， 观察动物机体所产生的总体毒性效应，通过不断反复的 资料积累作出毒理学评价并外推至人类，为防治暴露于环境有害因素的有害作用 提出综合性措施的过程第一节 急性毒性试验一、急性毒性急性毒性 (acute toxicity)是指机体 (人或实验动物 ) 一次或 24h之内多次接 触(染毒) 外源化学物之后，在短期内所发生的毒性效应，包括引起死亡效应实验动物接触外源化学物所引发的急性毒性效应出现的快慢和毒性反应的 强度，因外源化学物的性质 （主要为化学结构与理化性质）和染毒剂量的大小而 有很大差别 有的化学物在实验动物接触致死剂量后，几分钟之内即可产生中毒 症状，甚至瞬间死亡， 有的化学物则在接触致死剂量几天才出现明显的中毒症状 或死亡所谓“一次或 24 内多次”接触或染毒的时间界定：一次是指瞬间染毒，如 经口染毒、 经注射途径染毒， 但在经呼吸道与经皮肤染毒，则是指在一个特定的 期间内持续地接触化学物的过程，所以“一次”含有时间因素。

当外源化学物毒 性过低，或一次染毒剂量受机体容量限制，需给予实验动物较大剂量时，则可在 24h 内分次染毒，即为“多次”短期内”，一般限定为7 天内二、急性毒性试验的目的和方法（一）急性毒性试验的目的急性毒性研究的目的， 主要是探求化学物的致死剂量， 以初步评估其对人类 的可能毒害的危险性再者是求该化学物的剂量- 反应关系，为其它毒性实验打 下选择染毒剂量的基础二）实验动物的选择毒理学中研究外源化学物的基础毒性主要是进行体内试验，即是以实验动物 为研究对象，最终向外源化学物毒害主体—- 人类外推虽然在一些国家由于动 物保护运动的发展，进行整体动物研究受到一定限制，而促使体外试验的发展， 但毕竟用离体组织、细胞、亚细胞器为标本时距整体接触化学物的毒性有差距， 所以至今评价外源化学物基本毒性，还是以整体实验动物体内实验为主描述性动物实验研究采用的体外试验研究的模型标本包括某些离体脏器、组 织切片、原代细胞、 传代培养细胞、 组织匀浆、 亚细胞组分， 甚至昆虫、细菌等 不同种属的动物对同一受试物的毒性作用表现可有很大的差别，要获得较可靠的 实验结果， 一般应选用两种以上的实验动物常选用大白鼠和小白鼠。

根据不同 实验目的，可选用不同实验动物例如，皮肤刺激实验，可选用家兔，因为家兔 为皮肤刺激实验的敏感动物 动物应注明来源及品系 除特殊要求外， 动物年龄 一般选用初成年者： 大白鼠、小白鼠为出生后 2～3 个月左右，体重分别为 180～ 240g和 18～24g；家兔为 2～2.5kg ，猫为 1.5 ～2kg；狗为出生后一年左右选 用的动物体重差异不应超过平均体重的10% 动物的需用数量，大白鼠和小白鼠 每组 10 只以上；较大的动物如狗、 家兔等每组不少于3～5 只为判定受试物对 不同性别动物的毒性反应有否差异，除特殊要求外， 实验中一般均应采用两种性 别动物进行试验 所用动物进入实验室后， 于实验开始前应观察一周以上，以删 除不健康的动物，并使实验动物适应环境三）染毒途径和方式基础毒性研究，不论是急性、亚慢性与慢性毒性研究，主要是经口、经皮肤 及经呼吸道吸入三种染毒途径1、经口染毒① 灌胃 人工给实验动物灌入外源化学物是经常使用的经口染毒方法此时 外源化学物直接灌入胃内， 而不与口腔及食道接触， 故而给予的化学物剂量准确 但是，当待测化学物为气态或固体时均需用某种溶剂溶解，液态化学物往往也需 用溶剂溶解。

灌胃体积依所用实验动物而定，小鼠一次灌胃体积在0.1 ～0.5ml/kg 体重， 大鼠在 1.0ml/100g 体重之内，家兔在5ml/kg 体重之内，狗不超过50ml/10kg 体重② 喂饲 喂饲方法染毒是将化学物溶于无害的溶液中拌入饲料或饮用水中， 使动物自行摄入含化学物的饲料或水，然后依每日食入的饲料与水在推算动物实 际摄入化学物的剂量喂饲法的优点是接触化学物的方式符合人类接触污染食物与水的方式, 方法 简便、易操作但是由于动物 （尤其是啮齿类动物） 进食时浪费、损失饲料很多， 往往摄入的化学物量不准确， 仅适用于动物数量较大的毒理学实验如果化学物 有异味，动物可能拒食， 如果化学物在室温下可以挥发，或在饲料中和水中可以 水解，则剂量也不准确， 且有经呼吸道与皮肤交叉吸收的可能，喂饲法为了计算 每只动物摄入化学物的剂量， 一般要每只动物单笼饲养 由于此种方法更适宜进 行多日染毒，急性毒性试验一般不用之③ 吞咽胶囊将所需剂量的受试化学物装入药用胶囊内，强制放到动物的舌 后咽部迫使其咽下 此法剂量准确， 尤其适用于易挥发、 易水解和有异臭的化学 物兔、猫及狗等较大动物可用此法2、经呼吸道染毒凡是气态或易挥发的液态化学物均有经呼吸道吸入的可能，在生产过程中形 成气溶胶的化学物也可经呼吸道吸入。

经呼吸道染毒有两种类型， 一是动物自行 吸收，一是人工动物气管注入 动物自行吸入呼吸道染毒又分静式吸入染毒与动 式吸入染毒两种方法静式吸入染毒，即在一定容积的染毒柜内加入一定量受试物造成含一定浓度 受试物的空气环境， 使受试动物在规定时间内 , 经吸入而达到染毒， 故适用于短 时间染毒的试验使用动式吸入染毒， 即采用机械通风为动力， 连续不断地将含有已知浓度受试物 的新鲜空气送入染毒柜内，并排出等量的污染气体，使染毒浓度保持相对稳定， 这样可使染毒时间不受染毒柜( 室) 容积的限制， 也可避免动物缺氧、 二氧化碳积 聚、温度增加等对试验结果的可能影响，故适用于较长时间以及反复染毒的试验 使用气管注入，将液态或固态外源化学物注入肺内这是一个手术过程， 仅适用 于制造化学物对肺脏损伤模型的制备，而不用于一般毒性研究3、经皮肤染毒液态、气态和粉尘状外源化学物均有接触皮肤的机会外源化学物是否能经 皮肤吸收导致机体中毒或仅在皮肤局部引起损伤与外源化学物的性质有关能经 皮肤吸收的化学物主要以扩散方式经过皮肤角质层屏障，在表皮角质细胞的间质 中充满非极性的脂类物质 脂溶性化学物主要通过这种途径渗透入皮肤，所以角 质层薄的皮肤部位更易吸收。

表皮破损、 皮肤水化或脱水， 以及易于滞留于角质 层的化学物，均可增加化学物的渗透所以，研究外源化学物的经皮吸收时，皮 肤接触化学物的面积、时间长短、环境中温、湿度均应控制统一的条件再者， 年龄老的动物表皮厚度改变、 细胞成分也有变化， 所以应选择成年动物为宜 此 外，为保证不因皮肤部位不同而形成的化学物渗透率差异，一般大鼠、豚鼠、兔 均使用背部皮肤 面积则依据选用动物及受试物的剂量和剂型而定如，家兔可 取 5cm ×6cm 、 豚鼠取 3cm ×4cm 、 大鼠取 1.5cm～2.0cm 直径的面积，小鼠取 1.0cm ～1.5cm直径的面积实验前详细检查去毛部位皮肤有无擦伤、红肿、皮疹等异 常现象，剔除不合格动物 染毒时按单位体重确定给予所需毒剂的容量，故要求 配置成相应浓度的受试物 接触时间应与人实际接触该物质的时间相仿但在做 功能食品和药物的毒理学评价实验时，一般要求受试物接触时间适当延长，保证 对人体不受危害4、其它途径染毒有时需对外源化学物进行绝对毒性或比较毒性研究，或进行一些必要的特殊 研究( 如静脉注射毒物动力学、 代谢研究、 急救药物筛选等 ) ，往往用注射途径染 毒。

注射途径包括静脉注射 ( 大鼠、小鼠尾静脉，兔耳缘静脉)、肌肉注射、皮下 注射及小动物腹腔注射染毒但注射时应控制注射体积四）毒性反应的观察与检查根据急性毒性试验的目的， 受试动物给予受试物后， 应即刻密切观察各组动 物发生的毒性反应（全身的或局部的）情况，中毒症状的特点和出现时间，中毒 症状恢复时间， 动物发生中毒死亡的时间及死亡数，死亡动物必须的病理解剖检 查观察等急性毒性试验一般不作病理组织学和化验检查，但是有时为了发现某 些脏器或靶器官的损害情况， 或根据对一些受试物的特殊要求，亦可依据要求选 取有代表性的剂量组与对照组进行病理组织学显微镜检查和某些特异性指标的 化验检查试验的观察期限， 如受试动物于接触受试物后24～48h内中毒死亡， 未发现 有迟发中毒作用时，一般观察7～14d 即可否则应适当延长观察期限，直到中 毒症状基本恢复正常为止，延长观察需要2～4 周观察期限，特别要注意动物 的饲养和管理，以防止与受试物无关的意外死亡情况发生三、常用指标和毒性分级（一）急性致死毒性实验常用指标表示急性致死毒性最常用的指标是LD50，它是经过统计处理计算得出的数值 ，与 LD100、LD0等相比有更高的重现性；而且, 它反映受试群体中大多数动物易 感性的平均情况， 最后从剂量反应关系曲线上看， 它处于曲线上升的中段 , 是致 死率对剂量变化最敏感的部位。

但是，LD50只能表示一种外源化学物引起实验动 物死亡一半的剂量 (或浓度），即只能表示动物一半死亡，一半存活的剂量点的 界限，所以是一个质化反应，而不能代表受试化合物的急性中毒特性，因此，应 当注意到只用 LD50(LC50) 说明一个外源化学物的急性毒性是不够的有时，根据 实际需要还应进行联合毒性实验等其它有关参数，并仔细观察动物的中毒症状1、LD50的测定测定 LD50常选用成年小鼠和大鼠两个种属，有时需选用其它种属 无特殊要 求，雌雄两性各半 在正式实验前， 首先要了解受试化学物的化学结构和理化性 质，查阅有关文献， 找出与受试化学物化学结构近似或有共性基团化学物的毒性 资料，确定预试剂量预试一般每组4 只动物，每次 3 组，以 10 倍为组距根 据第一次预试结果判定需要增加还是降低剂量，组距保持不变， 直至粗略预测到 LD100及 LD0为止正式试验时一般每组10 只动物（使用兔或狗等大动物时不少于 4～6 只），在预测的LD100及 LD0之间安排 5～7 个剂量组，各剂量组间间距应根 据受试物毒性大小和预试结果而定，一般以0.65～0.85 的等比级数为宜LD50值的计算有多种方法，大体上可以归纳为两大类，其一是死亡率—剂量 反应相关要求为正态分配的，其中概率单位图解法和寇氏法(Karber) 较为常用。

另一类是不要求为正态分布的 （非正态分布） ，计算时只查对有关表格即可得到 LD50如何使用这些方法，应当按照受试化学物的具体情况分别对待这里简要 介绍改进寇氏法（ Karber ）氏法，又称平均致死量法适于此法的基本条件是， 要求每个染毒组实验动物数相同，至少 5 个实验组， 死亡率呈正态分布， 最低剂 量组死亡率小于 20% ，最高剂量组死亡率高于80% ，所选剂量对数差值相等该 计算公式如下 , 首先求出 logLD50及其 95% 的可信限，再求出LD50M = Xk – i( Σp – 0.05) Sm = pq Σn 式中: m — log LD50, Xk — 最高剂量组剂量对数值, p — 死亡率 ( 用小数表示 ) ，Σp— 死亡率总和 , q— 1 – p, i—相林两组剂量对数之差, n—每组动物数，在实验过程中， 应在染毒后的头 2～3h 内，或在吸入染毒的过程中， 仔细观 察所出现的症状，并计算1～2 周内的死亡数对于存活动物应于第2 周剖杀观 察各内脏的病理改变 在引起立即死亡时， 则直接观察死亡动物的呼吸器官及消 化道，其它它它它它它器官可不作检查。

由于中枢神经系统受抑而立即死亡的动 物不易在该系统找到病变，故一般不检查神经系统2、急性毒性分级为了粗略表示外源化学物急性毒性的强弱和其对人的潜在危害程度，国际上 提出了外源化学物的急性毒性分级（acute toxicity classification）但分 级标准并未完全统一 我国目前。