白腐真菌生物技术与应用.ppt

白腐真菌生物技术与应用白腐真菌生物技术与应用环境工程专业选修课环境工程专业选修课主讲教师主讲教师 胡长庆胡长庆课程安排与考核方式课程安排与考核方式学时数学时数  32学时（包括讨论课时）学时（包括讨论课时）白腐真菌白腐真菌生物学基础生物学基础（理论基础）（理论基础）白腐真菌白腐真菌生物技术生物技术（应用基础）（应用基础）白腐真菌在白腐真菌在环境保护中环境保护中的作用的作用（应用实践）（应用实践）考核方式考核方式  闭卷考核闭卷考核成绩分配成绩分配  平时占平时占40% ；；考核占考核占60%课程内容简介课程内容简介1白腐真菌生物学基础白腐真菌生物学基础 白腐真菌研究的历史、现状与未来白腐真菌研究的历史、现状与未来 白腐真菌生物学白腐真菌生物学（（概念、分类、特点、生物降解等概念、分类、特点、生物降解等））2白腐真菌生物技术白腐真菌生物技术 包括白腐真菌的培养、分离、酶技术、固定化技术等包括白腐真菌的培养、分离、酶技术、固定化技术等3白腐真菌在环境保护中的作用白腐真菌在环境保护中的作用 白腐真菌与水污染控制白腐真菌与水污染控制 白腐真菌与土壤污染控制白腐真菌与土壤污染控制 白腐真菌与重金属污染白腐真菌与重金属污染 白腐真菌与大气污染控制白腐真菌与大气污染控制 白腐真菌与有机固体废物资源化白腐真菌与有机固体废物资源化1白腐真菌生物学基础白腐真菌生物学基础 白腐真菌研究的历史、现状与未来白腐真菌研究的历史、现状与未来白腐真菌研究探索的历史白腐真菌研究探索的历史             20世纪世纪70年代至年代至20世纪世纪90年代年代白腐真菌研究繁荣的现状白腐真菌研究繁荣的现状         以分子生物学为特征的理论研究以分子生物学为特征的理论研究白腐真菌研究发展的未来白腐真菌研究发展的未来                     以工业化应用为终极目标以工业化应用为终极目标白腐真菌生物学白腐真菌生物学1、白腐真菌、白腐真菌（（White Rot Fungi））的概念的概念白腐真菌的概念白腐真菌的概念不是生物学术语不是生物学术语，而是一种，而是一种功能描述的概念功能描述的概念纤维素纤维素木腐真菌木腐真菌Wood Rotting Fungi木质木质纤维素纤维素Ligno-cellulose软腐真菌软腐真菌Soft rot Fungi褐腐真菌褐腐真菌Brown rot Fungi白腐真菌白腐真菌White rot Fungi木质素木质素半纤半纤维素维素多糖类多糖类软腐真菌软腐真菌：：主要降解纤维素主要降解纤维素，，对木质素降解对木质素降解                   缓慢且不彻底。

缓慢且不彻底褐腐真菌褐腐真菌：：主要降解纤维素、半纤维素和部主要降解纤维素、半纤维素和部                   分多糖类分多糖类，，几乎不降解木质素几乎不降解木质素白腐真菌白腐真菌：：主要降解木质素和多糖类主要降解木质素和多糖类，，对纤对纤                   维素和半纤维素降解能力弱维素和半纤维素降解能力弱小结小结到底什么是白腐真菌？到底什么是白腐真菌？白腐真菌的概念是从功能角度对其进行描述和界定的白腐真菌的概念是从功能角度对其进行描述和界定的白腐真菌是一类能够引起木质白色腐烂的丝状真菌白腐真菌是一类能够引起木质白色腐烂的丝状真菌主要降解木质素和多糖类，对纤维素和半纤维素降解主要降解木质素和多糖类，对纤维素和半纤维素降解能力弱能力弱白腐真菌嗜热性好氧微生物白腐真菌嗜热性好氧微生物2、白腐真菌的分类地位与主要种类、白腐真菌的分类地位与主要种类2-1 白腐真菌的分类地位白腐真菌的分类地位生物界生物界细细菌菌古古菌菌真真核核生生物物“生物三界学说生物三界学说” 示意图示意图       根据根据16S rRNA碱基序列特点碱基序列特点，，整个生物整个生物界被划分为细菌界被划分为细菌（（bacteria）、）、古菌古菌（（archaea））和真核生物和真核生物（（eukaryotes））3大超界大超界（（Domain））白腐真菌属于白腐真菌属于真核生物超界真核生物超界。

        木腐真菌已知的有木腐真菌已知的有1600～～1700种种，，大多数是担子菌和子囊菌大多数是担子菌和子囊菌软腐真菌软腐真菌：：子囊菌、半知菌子囊菌、半知菌褐腐真菌褐腐真菌：：大部分属于担子菌大部分属于担子菌白腐真菌白腐真菌：：主要是担子菌主要是担子菌，，少少                  数为子囊菌数为子囊菌2-2 白腐真菌的主要种类白腐真菌的主要种类        已知白腐真菌种类有已知白腐真菌种类有400多种多种，，研究最为透彻研究最为透彻，，被称为白腐真菌研究被称为白腐真菌研究模式菌种的是模式菌种的是黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌（（Phanerochaete chrysosporium Burdsal）） 黄孢原毛平革菌的生物学分类地位黄孢原毛平革菌的生物学分类地位担子菌门担子菌门Basidiomycota伏革菌科伏革菌科Corticiaceae非褶菌目非褶菌目Aphyllophorales层菌纲层菌纲Hymenomycetes原毛平革菌属原毛平革菌属Phanerochaete门门纲纲目目科科属属       黄孢原毛平革菌主要分布在北半球，其无性世代也被称为黄孢原毛平革菌主要分布在北半球，其无性世代也被称为多粉侧孢霉多粉侧孢霉（（Sporotrichum pulverulentum Novobranova）。

白腐真菌主要分布于白腐真菌主要分布于 8个菌属个菌属革盖菌属革盖菌属Coriolus原毛平革菌属原毛平革菌属Phanerochaete卧孔菌属卧孔菌属Poria层孔菌属层孔菌属Fomes多孔菌属多孔菌属Polyporus烟管菌属烟管菌属Bjerkandera侧耳属侧耳属Pleurotus栓菌属栓菌属Trametes研究较多，且表现出较强降解能力的菌种有研究较多，且表现出较强降解能力的菌种有20种种污色原毛平革菌污色原毛平革菌丝核菌丝核菌糙皮侧耳、平菇糙皮侧耳、平菇红孔菌红孔菌变色栓菌、云芝变色栓菌、云芝韧革菌韧革菌漏斗状侧耳、凤尾菇漏斗状侧耳、凤尾菇多孔菌多孔菌毛栓菌毛栓菌短射脉菌短射脉菌裂褶菌、树花裂褶菌、树花金孢霉菌金孢霉菌烟管菌烟管菌短孢射脉菌短孢射脉菌维氏针层孔菌维氏针层孔菌拟蜡菌拟蜡菌香菇、椎茸香菇、椎茸毛革盖菌毛革盖菌木蹄层孔菌木蹄层孔菌射脉菌射脉菌3、白腐真菌的生理特点、白腐真菌的生理特点        白腐真菌是一个庞大的生物家族，各成员的生理特点会表现出很大白腐真菌是一个庞大的生物家族，各成员的生理特点会表现出很大的差异       笼统的谈白腐真菌的生理生化特征和性质，既不现实，也不准确。

笼统的谈白腐真菌的生理生化特征和性质，既不现实，也不准确黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌 黄孢原毛平革菌具有发达的菌丝体，菌丝常为多核，少有隔膜，无黄孢原毛平革菌具有发达的菌丝体，菌丝常为多核，少有隔膜，无锁状联合锁状联合多核分生孢子常为异核，担孢子却是同核体多核分生孢子常为异核，担孢子却是同核体交配系统有交配系统有同同宗交配和异宗交配宗交配和异宗交配 黄孢原毛平革菌的生长具有营养生长期和子实体生长期黄孢原毛平革菌的生长具有营养生长期和子实体生长期 锁状联合锁状联合：担子菌的次生菌丝每一个细胞都有二个核，其中一个核来自母：担子菌的次生菌丝每一个细胞都有二个核，其中一个核来自母本，一个来自父本，当双核细胞进行细胞分裂时，在二个核之间外生一个短小本，一个来自父本，当双核细胞进行细胞分裂时，在二个核之间外生一个短小弯曲的分枝，核移动，在二核之间生出一个突起如钩状，一个核进入钩，一个弯曲的分枝，核移动，在二核之间生出一个突起如钩状，一个核进入钩，一个留在菌丝钩中保留一个核，一个往后移，菌丝中二个核一往前一个往后移钩留在菌丝钩中保留一个核，一个往后移，菌丝中二个核一往前一个往后移钩状突起向下弯曲与细胞壁接触溶化，分枝基部生分隔膜（分隔中间有孔道），状突起向下弯曲与细胞壁接触溶化，分枝基部生分隔膜（分隔中间有孔道），在原分支外形成一隔膜，产生一个新细胞双核体，在分隔处保留一个桥形结构。

在原分支外形成一隔膜，产生一个新细胞双核体，在分隔处保留一个桥形结构分生孢子分生孢子 无性繁殖，通过无性繁殖，通过菌丝体的裂殖产生菌丝体的裂殖产生担孢子担孢子 有性繁殖，必须通过菌丝体细胞的有性繁殖，必须通过菌丝体细胞的锁状联合过程锁状联合过程同宗交配和异宗交配同宗交配和异宗交配两条可互相两条可互相交配的单核交配的单核菌丝融合菌丝融合担孢子担孢子一次菌丝一次菌丝担孢子担孢子一次菌丝一次菌丝单核单核萌发萌发二次菌丝二次菌丝双核双核二次菌丝二次菌丝担孢子担孢子······ 只要同一孢子萌发的单核菌丝间的互相结合生出只要同一孢子萌发的单核菌丝间的互相结合生出双核菌丝后，就可形成子实体，这种现象称为双核菌丝后，就可形成子实体，这种现象称为同宗交同宗交配配反之，只有异性的单核菌丝（不同孢子），才能反之，只有异性的单核菌丝（不同孢子），才能结合成双核菌丝，这种结合方式称为结合成双核菌丝，这种结合方式称为异宗交配异宗交配3-1 白腐真菌的生长与代谢特点白腐真菌的生长与代谢特点（（黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌））营养期营养期初生生长初生生长白腐真菌白腐真菌繁殖期繁殖期次生生长次生生长停滞期停滞期对数期对数期细菌细菌静止期静止期 生长是线性的，生物量生长是线性的，生物量显著增加。

显著增加 生长基本停滞，甚至发生生长基本停滞，甚至发生生物量的下降生物量的下降诱因：诱因：  氮限制氮限制（（nitrogen limitation, N-L））  碳限制碳限制（（carbon limitation, C-L ））N-L在木质素降解中的作用在木质素降解中的作用:       实质上是白腐真菌在进化过程中对环境中氮缺乏的一种生理适应实质上是白腐真菌在进化过程中对环境中氮缺乏的一种生理适应C-L在木质素降解中的作用在木质素降解中的作用:       主要是它和菌丝体质量的减少像偶联，从而启动了次生代谢主要是它和菌丝体质量的减少像偶联，从而启动了次生代谢与木质素降解有关的几个基本概念与木质素降解有关的几个基本概念营养限制营养限制N-L和和C-L木质素的降解木质素的降解木质素降解酶的合成木质素降解酶的合成要求要求木质素降解条件木质素降解条件Ligninolytic condition培养体系培养体系生理特征生理特征参与的酶参与的酶木质素降解培养木质素降解培养Ligninolytic culture木质素降解活性（木质素降解活性（木质素降解活动木质素降解活动））Ligninolytic activity木质素降解酶木质素降解酶Ligninolytic enzyme白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢(cometabolized)过程过程木质素木质素完成降解过程完成降解过程白腐真菌白腐真菌？？+ +生长底物生长底物Growth substrate白腐真菌白腐真菌共代谢的两种方式共代谢的两种方式1、某种生物将一种底物转化，却无法在这种底物上生长，即生物体、某种生物将一种底物转化，却无法在这种底物上生长，即生物体不能利用这种底物氧化所产生的能量去维持生长。

不能利用这种底物氧化所产生的能量去维持生长2、一些生物为了共同的效应，共用其生物化学资源，协同作用，对、一些生物为了共同的效应，共用其生物化学资源，协同作用，对化合物进行降解化合物进行降解白腐真菌降解木质素属于何种方式？白腐真菌降解木质素属于何种方式？小结小结 3-1白腐真菌的生长与代谢特点白腐真菌的生长与代谢特点白腐真菌的生长具有营养生长期和子实体生长期白腐真菌的生长具有营养生长期和子实体生长期锁状联合锁状联合 分生孢子分生孢子 担孢子担孢子 同宗交配同宗交配 异宗交配异宗交配营养期白腐真菌生长是线性的，生物量显著增加；营养期白腐真菌生长是线性的，生物量显著增加；繁殖期（子实体体生长期）生长基本停滞，甚至繁殖期（子实体体生长期）生长基本停滞，甚至发生生物量的下降发生生物量的下降氮限制（氮限制（N-L））  碳限制（碳限制（C-L ））白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢过程白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢过程共代谢的两种方式共代谢的两种方式3-2 白腐真菌在培养中的特点白腐真菌在培养中的特点（（黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌））这里的培养特指实验室中小规模的这里的培养特指实验室中小规模的, ,以研究基本规律为目的的培养以研究基本规律为目的的培养接种物接种物接种接种方式方式菌丝体菌丝体孢子孢子按干重或是湿重计量按干重或是湿重计量优点：优点：能准确量化能准确量化      能保证碳、氮营养限制能保证碳、氮营养限制应用范围：应用范围：基础研究和应用研基础研究和应用研      究初期究初期接种方式：接种方式：制备孢子悬浮液制备孢子悬浮液     （（spore suspension, SS）按）按　　培养基量成一定比例接入　　培养基量成一定比例接入关键是关键是接种物接种物的定量的定量培养方式培养方式( (实实验验室室规规模模的的一一般般性性培培养养) )按按培培养养基基的的物物理理状状态态划划分分半固体培养体系半固体培养体系固体培养体系固体培养体系液体培养体系液体培养体系静置培养静置培养Standing culture振荡培养振荡培养Shaking culture静置培养静置培养Standing culture固定台面固定台面孢子孢子1-2天天菌丝垫或菌垫菌丝垫或菌垫Mycelial mat条件适宜条件适宜10天左右天左右…………白色粉状物白色粉状物—孢子孢子1、、尽量采取浅层培养方式；尽量采取浅层培养方式；2、、尽量避免菌尽量避免菌墊墊起褶，尤其在培养初期菌起褶，尤其在培养初期菌墊墊很薄的时候；很薄的时候；3、、氧气的扩散速度是静置培养时决定白腐真菌降解木质素能力的限制性因子；氧气的扩散速度是静置培养时决定白腐真菌降解木质素能力的限制性因子；振荡培养振荡培养Shaking culture振荡培养仪器振荡培养仪器孢子孢子1-3天天菌丝团或菌团菌丝团或菌团Mycelial pellets1、、菌团的大小及数量随接种量和菌团的大小及数量随接种量和转速而变化：接种量大，菌团大；转速而变化：接种量大，菌团大；转速越大，菌团越小，数目越多；转速越大，菌团越小，数目越多；（（100 mL三角烧瓶三角烧瓶→40 mL培养液）培养液）2、、一般而言，在一般而言，在100～～200r/min条件下，菌团条件下，菌团直径在直径在3～～5mm；；3、、主要为细菌系统建立的振荡培养技术，实际上并不适合直接应用于白腐主要为细菌系统建立的振荡培养技术，实际上并不适合直接应用于白腐真菌系统，主要是由于白腐真菌对振荡所产生的机械剪切力高度敏感；真菌系统，主要是由于白腐真菌对振荡所产生的机械剪切力高度敏感；固体培养体系固体培养体系白腐真菌的固体培养主要是平板培养，少量进行斜面培养。

白腐真菌的固体培养主要是平板培养，少量进行斜面培养平板培养的目的：平板培养的目的：① ① 扩大菌的生物量或是大量获得孢子；扩大菌的生物量或是大量获得孢子；② ② 鉴定菌的酶活性鉴定菌的酶活性 或扫描菌对化学物质的降解能力；或扫描菌对化学物质的降解能力；③ ③ 用于菌种的分离筛选、用于菌种的分离筛选、 诱变、驯化或是短期的保藏；诱变、驯化或是短期的保藏；斜面培养的目的：斜面培养的目的：菌种的中、长期保藏；菌种的中、长期保藏；孢子或菌丝体孢子或菌丝体平板培养平板培养斜斜面面培培养养数日数日数日数日气相气相生长生长气相气相生长生长菌丝层菌丝层菌丝层菌丝层气生孢子气生孢子气生孢子气生孢子3-3 环境因子对白腐真菌代谢活动的影响环境因子对白腐真菌代谢活动的影响（（黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌））白腐真菌白腐真菌生理活动生理活动木质素降解木质素降解酶的合成酶的合成木质素降解木质素降解酶的活性酶的活性环境因子环境因子培养参数的操作、培养参数的操作、调控和优化调控和优化菌的代谢或降解潜能菌的代谢或降解潜能开发利用的关键开发利用的关键建立一个合理的建立一个合理的反应体系反应体系涉及的环境因子或培养条件包括：涉及的环境因子或培养条件包括：    ①① 培养基成分；培养基成分；②② 活性添加成分；活性添加成分；③③ 氧；氧； ④④ pH；；⑤⑤ 温度温度培养基成分培养基成分实验培养最佳碳源为葡萄糖实验培养最佳碳源为葡萄糖碳源物质碳源物质香草酸钠香草酸钠: :支持菌的生长支持菌的生长, ,也可支持木质素降解也可支持木质素降解; ;葡萄糖酸钠葡萄糖酸钠: :支持菌的生长支持菌的生长, ,但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠; ;葡萄糖酸内酯葡萄糖酸内酯: :支持菌的生长支持菌的生长, ,但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠; ;甘油甘油: :可当碳源也可能源可当碳源也可能源, ,支持木质素降解支持木质素降解, ,是筛选菌突变体的碳源是筛选菌突变体的碳源; ;琥珀酸钠琥珀酸钠: :可当碳源也可能源可当碳源也可能源, ,支持木质素降解支持木质素降解; ;葡萄糖葡萄糖: :支持菌的生长支持菌的生长, ,支持木质素矿化程度高支持木质素矿化程度高; ;纤维素纤维素: :支持菌的生长支持菌的生长, ,支持木质素矿化程度极高支持木质素矿化程度极高; ;优优劣劣氮源物质氮源物质营养氮源的种类对木质素降解的影响不大，重要的是氮源的浓度；营养氮源的种类对木质素降解的影响不大，重要的是氮源的浓度；氮丰富状态对木质素代谢会产生负面影响；氮丰富状态对木质素代谢会产生负面影响；铵类氮源会抑制一些酶的合成，产生铵类氮源会抑制一些酶的合成，产生““氨代谢物抑制氨代谢物抑制””现象；现象；维生素维生素缓冲成分缓冲成分金属成分金属成分硫胺素是白腐真菌生长和木质素代谢的必须成分；硫胺素是白腐真菌生长和木质素代谢的必须成分；乙酸钠、琥珀酸钠、酒石酸钠是三种最为常用的缓冲成分；乙酸钠、琥珀酸钠、酒石酸钠是三种最为常用的缓冲成分；主要功能，或作为一般的营养元素，或作为酶的结构组成和活性因子；主要功能，或作为一般的营养元素，或作为酶的结构组成和活性因子；活性添加成分活性添加成分        活性添加成分（活性添加成分（activated additive）有利于提高或保护木质素降解系统，）有利于提高或保护木质素降解系统，可以提高培养体系的反应性。

可以提高培养体系的反应性VA（藜芦醇，（藜芦醇，3,4-二甲氧基苯甲醇）二甲氧基苯甲醇）        白腐真菌本身在生长过程中可以产生白腐真菌本身在生长过程中可以产生VA（次生代谢物），外源加入一（次生代谢物），外源加入一定量的定量的VA可以显著提高木质素过氧化物酶的合成及活性可以显著提高木质素过氧化物酶的合成及活性芳族化合物芳族化合物         起到氧化还原调节剂的作用，常见的有起到氧化还原调节剂的作用，常见的有3,4-二甲氧基苯甲醇和二甲氧基苯甲醇和3-羟基邻氨羟基邻氨基苯甲酸盐基苯甲酸盐有机酸有机酸表面活性剂表面活性剂        有机酸，如甘醇酸（有机酸，如甘醇酸（glycolate）、乙醛酸（）、乙醛酸（glyoxylate）、草酸（）、草酸（oxalate））等，可以促进木质素降解活动其中，草酸的作用尤其引起重视，草酸具有刺等，可以促进木质素降解活动其中，草酸的作用尤其引起重视，草酸具有刺激锰过氧化物酶及调节细胞外酸碱度的功能激锰过氧化物酶及调节细胞外酸碱度的功能        白腐真菌液体培养体系中加入表面活性剂可以有效地保护木质素降解酶免白腐真菌液体培养体系中加入表面活性剂可以有效地保护木质素降解酶免受因机械剪切力所造成的结构破坏或活性丧失。

受因机械剪切力所造成的结构破坏或活性丧失        最为常用的表面活性剂最为常用的表面活性剂Tween 80（吐温（吐温80））氧氧 环境中氧的浓度对白腐真菌的生理代谢及木质素降解活动有很大影响环境中氧的浓度对白腐真菌的生理代谢及木质素降解活动有很大影响但是，绝对不能简单的认为是氧的绝对浓度问题，但是，绝对不能简单的认为是氧的绝对浓度问题，起关键作用的是白腐真起关键作用的是白腐真菌真正所能获得的有效氧的多寡菌真正所能获得的有效氧的多寡pH        白腐真菌生长所需的适宜白腐真菌生长所需的适宜pH为为5.5左右，稍高于木质素降解所要求的最左右，稍高于木质素降解所要求的最佳佳pH 4.5当培养体系当培养体系pH低于低于3.5或是高于或是高于4.5的情况下，会显著抑制木质素的情况下，会显著抑制木质素的降解和降解酶系统的工作的降解和降解酶系统的工作温度温度        白腐真菌生长扩增所需的温度范围在白腐真菌生长扩增所需的温度范围在25～～39℃，要求并不十分严格要求并不十分严格4、白腐真菌酶学简介、白腐真菌酶学简介4-1 白腐真菌主要酶种概述白腐真菌主要酶种概述H2O2产生酶系产生酶系葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶乙乙二二醛醛氧氧化化酶酶甲甲醇醇氧氧化化酶酶VA氧氧化化酶酶其其他他酶酶其他酶系其他酶系过氧化物歧化酶过氧化物歧化酶葡糖苷酶葡糖苷酶苯丙氨酸解氨酶苯丙氨酸解氨酶还原脱卤酶系统还原脱卤酶系统醌还原酶醌还原酶芳烃硝基还原酶芳烃硝基还原酶蛋白酶蛋白酶木质素氧化酶系木质素氧化酶系需需H2O2的过氧化酶的过氧化酶漆漆酶酶Lac木木质质素素过过氧氧化化物物酶酶LiP锰锰过过氧氧化化物物酶酶MnP白腐真菌木质素降解酶系统（白腐真菌木质素降解酶系统（ligninolytic enzyme system ））H2O2产生酶系产生酶系共同作用：以小分子有机物为底物，将分子氧化还原为共同作用：以小分子有机物为底物，将分子氧化还原为H2O2。

葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶         细胞内合成分泌到细胞外环境，将糖类物质氧化还原为细胞内合成分泌到细胞外环境，将糖类物质氧化还原为H2O2乙二醛氧化酶乙二醛氧化酶        为细胞外的含铜氧化酶，主要以醛类物质为底物而醛类物质为细胞外的含铜氧化酶，主要以醛类物质为底物而醛类物质恰好是葡萄糖氧化的中间产物恰好是葡萄糖氧化的中间产物其他酶其他酶        参与参与H2O2的产生主要有甲醇氧化酶，的产生主要有甲醇氧化酶，VA氧化酶等氧化酶等漆酶漆酶（（Lac））木质素过氧化物酶（木质素过氧化物酶（LiP））        能氧化高氧化还原电位的化合物，催化酚类、能氧化高氧化还原电位的化合物，催化酚类、非酚类物质氧化，参与木质素解聚非酚类物质氧化，参与木质素解聚锰过氧化物酶（锰过氧化物酶（MnP））        表现出对锰二价离子的绝对需要，氧化氧化还表现出对锰二价离子的绝对需要，氧化氧化还原电位相对低的化合物，如胺类、染料，在脱色反原电位相对低的化合物，如胺类、染料，在脱色反应中起主要作用，参与木质素解聚应中起主要作用，参与木质素解聚木木质质素素氧氧化化酶酶系系需需H2O2的过氧化酶的过氧化酶含铁的血红蛋白含铁的血红蛋白胞外酶胞外酶含铜多酚氧化酶（对二酚氧化酶）含铜多酚氧化酶（对二酚氧化酶）        以单酚、二酚、二胺、多酚类化合物为底物。

对非酚类物质，特别是蒽、以单酚、二酚、二胺、多酚类化合物为底物对非酚类物质，特别是蒽、苯并芘，多环芳烃类作用显著参与木质素的解聚和降解苯并芘，多环芳烃类作用显著参与木质素的解聚和降解其他酶系其他酶系过氧化物歧化酶过氧化物歧化酶        保护白腐真菌活细胞中过氧化物自由基免遭氧化压力；保护白腐真菌活细胞中过氧化物自由基免遭氧化压力；葡糖苷酶葡糖苷酶         具有糖基化的活性，在废水脱色中起着重要作用；具有糖基化的活性，在废水脱色中起着重要作用；苯丙氨酸解氨酶苯丙氨酸解氨酶         与与VA的生物合成密切相关；的生物合成密切相关；还原脱卤酶系统还原脱卤酶系统         能还原卤素基团；能还原卤素基团；醌还原酶醌还原酶         能产生氢醌，对木质素及环境污染物的降解极其重要；能产生氢醌，对木质素及环境污染物的降解极其重要；芳烃硝基还原酶芳烃硝基还原酶         是硝基芳香族化合物降解的关键；是硝基芳香族化合物降解的关键；蛋白酶蛋白酶         具体情况尚不明确；具体情况尚不明确；木质素过氧化物酶（木质素过氧化物酶（LiP）的分离和检测）的分离和检测LiP的分离的分离4-2 主要木质素降解酶的分离、提纯和检测方法主要木质素降解酶的分离、提纯和检测方法LiP的粗制品的粗制品液体培养液体培养细胞外液细胞外液6天天上清液上清液12000～～18000g 离心离心10～～30分钟分钟去除菌丝和孢子去除菌丝和孢子粗酶液粗酶液4℃保存保存24hDEAE树脂树脂4℃，离子交换，离子交换LiP的粗制品的纯化的粗制品的纯化DEAE离子交换柱离子交换柱LiP的纯化制品的纯化制品NaCl梯度溶液梯度溶液洗脱洗脱LiP的标准检测方法的标准检测方法基本原理基本原理藜芦醇（藜芦醇（VA））藜芦醛（藜芦醛（VAd））LiP催化催化H2O2320nm无吸收无吸收强烈吸收强烈吸收反应体系反应体系操作要点操作要点2mmol/L VA50mmol/L 酒石酸（酒石酸（pH 3.0～～3.5））0.4mmol/L H2O2一定量的酶液一定量的酶液        H2O2使用前新鲜配制；使用前新鲜配制；30℃反应时间反应时间10分钟；分钟；pH保持在保持在3.0～～3.5；；使用使用1cm石英比色皿，各比色皿总体积差额用蒸馏水补足；石英比色皿，各比色皿总体积差额用蒸馏水补足；VA使用真使用真空蒸馏或是在醚中萃取的方法进行纯化；空蒸馏或是在醚中萃取的方法进行纯化；锰过氧化物酶（锰过氧化物酶（MnP）的纯化和检测）的纯化和检测MnP的纯化的纯化菌的培养液用玻璃棉过滤，获得粗过滤液菌的培养液用玻璃棉过滤，获得粗过滤液超过滤法浓缩过滤物，使其浓度增加超过滤法浓缩过滤物，使其浓度增加20倍倍用去离子水按用去离子水按1:1比例进行稀释比例进行稀释使用使用DEAE阴离子交换柱吸附阴离子交换柱吸附洗涤洗涤50mL蒸馏水蒸馏水20mmol/L酒石酸钠（含酒石酸钠（含0.4mol/L NaCl））洗脱蛋白质洗脱蛋白质超过滤法除盐超过滤法除盐或浓缩或浓缩冰冻干燥，冰冻干燥，-20℃保存保存所有纯化步骤在所有纯化步骤在4℃进行，通过上述方法制备的酶制品可以保存进行，通过上述方法制备的酶制品可以保存1年不失活年不失活MnP的基本测定方法的基本测定方法利用各种芳香族底物，在补充锰（利用各种芳香族底物，在补充锰（Ⅱ）离子的条件下，均可进行）离子的条件下，均可进行MnP的测定。

的测定表表    用于用于MnP测定的底物及相关波长数据测定的底物及相关波长数据底物底物波长波长/nm亚香草基丙酮亚香草基丙酮3362,6-二甲氧基苯酚二甲氧基苯酚（（DMP））568丁香酸丁香酸260愈创木酚愈创木酚465姜黄素姜黄素430丁香醛连氮丁香醛连氮525松柏醇松柏醇263邻联（二）茴香胺邻联（二）茴香胺460MnP的基本测定方法具体步骤的基本测定方法具体步骤1mL反应混合液反应混合液0.1mmol/L酒石酸钠酒石酸钠（（pH 5.0））0.1mmol/L底物底物0.1mmol/L MnSO4适量的酶液适量的酶液光程光程1cm、体积、体积1.5mL石英比色皿，室温石英比色皿，室温加入加入0.1mmol/L H2O2以不加以不加H2O2的反应体系为对照；的反应体系为对照；1U为每分钟氧化为每分钟氧化1微摩尔每升底微摩尔每升底物的物的MnP；；启动反应启动反应MnP其他具有代表性的测定方法还包括其他具有代表性的测定方法还包括ABTS氧化法，氧化法，Mn(Ⅱ)氧化法和酚红法氧化法和酚红法漆酶（漆酶（Lac）的定性和定量检测方法）的定性和定量检测方法Lac的定性检测方法的定性检测方法Lac的定量检测方法的定量检测方法愈创木酚法：愈创木酚法：在含在含0.02%（质量浓度）愈创木酚的平板上可以鉴定细胞（质量浓度）愈创木酚的平板上可以鉴定细胞外液中外液中Lac的活性，的活性，Lac催化愈创木酚聚合形成红棕色的区带。

催化愈创木酚聚合形成红棕色的区带1mmol/L愈创木酚愈创木酚50mmol/L乙酸钠乙酸钠pH4.5适量的酶液适量的酶液37℃，，5分钟分钟465nm处测定吸光度处测定吸光度       一个酶活单位定义为每分钟引起波长一个酶活单位定义为每分钟引起波长465nm处吸光度一个处吸光度一个0.01单位变化所需的酶液量单位变化所需的酶液量5、白腐真菌分子生物学简介、白腐真菌分子生物学简介黄孢原毛平革菌的分子生物学黄孢原毛平革菌的分子生物学其他白腐真菌的分子生物学其他白腐真菌的分子生物学木质素降解过氧化物酶的分子生物学木质素降解过氧化物酶的分子生物学未来发展趋势：破解各类白腐真菌基因图谱未来发展趋势：破解各类白腐真菌基因图谱6、白腐真菌的生物降解、白腐真菌的生物降解6-1 白腐真菌生物降解的特点白腐真菌生物降解的特点非专一性非专一性nonspecific非水解性非水解性nonhydrolytic细胞外性细胞外性extracellular        白腐真菌能降解各种不同的化合物，具有广谱的底物范围白腐真菌能降解各种不同的化合物，具有广谱的底物范围其对作用底物的结构和类型要求是高度非特异性的。

其对作用底物的结构和类型要求是高度非特异性的        白腐真菌在生物降解过程中白腐真菌在生物降解过程中并不出现通常的酶的水解反应并不出现通常的酶的水解反应        白腐真菌通过细胞外酶的作用白腐真菌通过细胞外酶的作用对木质素类物质进行氧化分解对木质素类物质进行氧化分解木质素的结构特征木质素的结构特征6-2 白腐真菌生物降解系统白腐真菌生物降解系统白腐真菌生物降解系统的概念白腐真菌生物降解系统的概念营养限制营养限制N-L和和C-L木质素的降解木质素的降解木质素降解酶的合成木质素降解酶的合成要求要求木质素降解条件木质素降解条件Ligninolytic condition参与的组分参与的组分木质素降解系统木质素降解系统Lignin degradation system, LDS白腐真菌生物降解系统白腐真菌生物降解系统         泛指所有白腐真菌在适宜的条件下所泛指所有白腐真菌在适宜的条件下所形成的参与生物降解活动的组分的集合形成的参与生物降解活动的组分的集合白腐真菌生物降解系统的组成白腐真菌生物降解系统的组成酶组分酶组分小分子有机物小分子有机物白腐真菌生物降解系统白腐真菌生物降解系统产产过过氧氧化化氢氢的的酶酶过过氧氧化化物物酶酶其其他他酶酶种种VA草草酸酸HAA3-羟基羟基-邻氨基苯甲酸（氨茴酸）邻氨基苯甲酸（氨茴酸）注意：注意：1、葡萄糖氧化酶和乙二醛氧化酶的区别；、葡萄糖氧化酶和乙二醛氧化酶的区别；                     葡萄糖氧化酶是细胞内酶，乙二醛氧化酶为细胞外酶葡萄糖氧化酶是细胞内酶，乙二醛氧化酶为细胞外酶            2、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的异同点；、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的异同点；                    相同点：相同点：均在细胞内合成，分泌到细胞外，以均在细胞内合成，分泌到细胞外，以H2O2为最初氧化底物，触发为最初氧化底物，触发                                     酶的催化循环；酶的催化循环；                    不同点：不同点：Lip主要催化非酚类的芳香族化合物，只与木质素解聚有关，主要催化非酚类的芳香族化合物，只与木质素解聚有关，MnP                                    主要催化酚类化合物，与主要催化酚类化合物，与H2O2产生和木质素解聚均相关；产生和木质素解聚均相关；白腐真菌生物降解系统的基本要求白腐真菌生物降解系统的基本要求1 1、一种共底物，不能以木质素或是其他降解底物为唯一碳源；、一种共底物，不能以木质素或是其他降解底物为唯一碳源；2 2、底物的不可诱导性；、底物的不可诱导性；3 3、只在次生代谢期间得以表达；、只在次生代谢期间得以表达；4 4、因碳、氮、硫等的限制而触发；、因碳、氮、硫等的限制而触发；5 5、能被一些化学物质所强烈抑制；、能被一些化学物质所强烈抑制；6 6、对微量金属元素平衡的敏感；、对微量金属元素平衡的敏感；7 7、相对狭窄的酸碱度范围；、相对狭窄的酸碱度范围；8 8、明显地受氧气浓度的影响；、明显地受氧气浓度的影响；6-3 白腐真菌生物降解的机制白腐真菌生物降解的机制木质素的降解机制木质素的降解机制木质素的部分结构示意图木质素的部分结构示意图        木质素是由类苯丙烷亚单位非线性木质素是由类苯丙烷亚单位非线性随机连接形成的天然生物聚合物。

随机连接形成的天然生物聚合物木质素主要前体物木质素主要前体物对豆香醇对豆香醇         松柏醇松柏醇                         芥子醇芥子醇愈愈创创木木基基木木质质素素愈愈创创木木基基丁丁香香基基木木质质素素愈愈创创木木基基丁丁香香基基对对羟羟苯苯基基木木质质素素主主要要存存在在于于草草本本植植物物中中主主要要存存在在于于裸裸子子植植物物中中主主要要存存在在于于木木本本植植物物中中木质素的主要种类木质素的主要种类木质素的降解过程木质素的降解过程木质素木质素脱甲基化脱甲基化羟基化羟基化芳环开裂芳环开裂白腐真菌细胞外酶白腐真菌细胞外酶愈创木基和丁香基亚单位愈创木基和丁香基亚单位甲氧基含量减少甲氧基含量减少邻苯二酚邻苯二酚脂肪羧酸脂肪羧酸水解水解1、侧链中：发生氧化形成羰基和羧基；、侧链中：发生氧化形成羰基和羧基；2、芳环中：脱甲基化形成邻苯二酚后发生氧化开裂；、芳环中：脱甲基化形成邻苯二酚后发生氧化开裂；3、环裂片段进一步被降解，释放出脂肪类产物和新的酚羟基单位，然后降解；、环裂片段进一步被降解，释放出脂肪类产物和新的酚羟基单位，然后降解；4、侧链断裂与芳环开裂几乎同时发生；、侧链断裂与芳环开裂几乎同时发生；化学物质的降解机制化学物质的降解机制氧化机制氧化机制          包括包括LiP和和MnP的过氧化物酶，利用的过氧化物酶，利用H2O2促进化学物质发生单电子氧化形成自由基。

促进化学物质发生单电子氧化形成自由基氧氧化化机机制制依赖依赖MnP催化的氧化催化的氧化氧化机制类似于氧化机制类似于LiP的直接氧化，但表现出对的直接氧化，但表现出对Mn的绝对需要的绝对需要依赖依赖LiP的氧化的氧化直接氧化直接氧化间接氧化间接氧化         被氧化化学物质不必与酶发生结合，氧化通过简单的被氧化化学物质不必与酶发生结合，氧化通过简单的电子传递而发生主要氧化的化学物质为电子传递而发生主要氧化的化学物质为PAH类、氰化物类、氰化物和染料        依靠某种中介物（调节剂）相助进行氧化主要氧化的依靠某种中介物（调节剂）相助进行氧化主要氧化的化学物质为木质素、有机酸等化学物质为木质素、有机酸等还原机制还原机制       白腐真菌对化学物质的降解过程中还原机制存在两种类型，一是白腐真菌对化学物质的降解过程中还原机制存在两种类型，一是依赖依赖LiP的的还原还原，一是，一是依赖依赖MnP的还原的还原脱毒机制脱毒机制       有机化合物之所以能抵御生物降解是由于其毒性，能对生物造成毒效应有机化合物之所以能抵御生物降解是由于其毒性，能对生物造成毒效应白腐真菌对化学物质的降解过程就涉及到其解毒机制。

白腐真菌的解毒机制白腐真菌对化学物质的降解过程就涉及到其解毒机制白腐真菌的解毒机制主要有两种，即主要有两种，即酚类化合物的甲基化酚类化合物的甲基化和和化学物质依赖于细胞质膜的还原反应化学物质依赖于细胞质膜的还原反应6-4 白腐真菌生物降解的广谱性白腐真菌生物降解的广谱性白腐真菌种类的多样性白腐真菌种类的多样性白腐真菌特殊的降解机制白腐真菌特殊的降解机制白腐真菌对广谱的化学物质具有白腐真菌对广谱的化学物质具有敏感性和进攻性敏感性和进攻性目前白腐真菌可以有效降解的具有代表性的化学物质大类共有目前白腐真菌可以有效降解的具有代表性的化学物质大类共有16类类单苯化合物单苯化合物        苯、甲苯、乙苯和二甲苯（分别简称为苯、甲苯、乙苯和二甲苯（分别简称为B、、T、、E和和X，合称，合称BTEX），是一类重要的），是一类重要的有机污染物有机污染物白腐真菌对这类有机污染物质的降解效果，从底物的敏感性来排序：白腐真菌对这类有机污染物质的降解效果，从底物的敏感性来排序：E＞＞T＞＞X＞＞B（乙苯＞甲苯＞二甲苯＞苯）（乙苯＞甲苯＞二甲苯＞苯）氯苯氯苯        氯苯是优先污染物，作为溶剂、脱脂剂、甜味剂和各类农药，染料合成的中间体氯苯是优先污染物，作为溶剂、脱脂剂、甜味剂和各类农药，染料合成的中间体被广泛使用。

被广泛使用白腐真菌对这类有机污染物质的降解效果，按照降解速率来排序：白腐真菌对这类有机污染物质的降解效果，按照降解速率来排序：单氯苯＞间二氯苯＞邻二氯苯＞对二氯苯单氯苯＞间二氯苯＞邻二氯苯＞对二氯苯苯胺苯胺     主要是降解主要是降解3,4-二氯苯胺（二氯苯胺（DCA）氯酚氯酚       氯酚是污染物的大类，也是造纸废水的主要成分白腐真菌主要降解五氯苯酚氯酚是污染物的大类，也是造纸废水的主要成分白腐真菌主要降解五氯苯酚（（PCP）、单氯苯酚（）、单氯苯酚（CP）、二氯苯酚（）、二氯苯酚（DCP）和三氯苯酚（）和三氯苯酚（TCP）联苯联苯         联苯类物质由于疏水性和稳定性，在环境中可以长期存在，对人及各种生物构成联苯类物质由于疏水性和稳定性，在环境中可以长期存在，对人及各种生物构成毒性白腐真菌主要降解多氯联苯（毒性白腐真菌主要降解多氯联苯（PCB）和联苯硝基芳烃化合物硝基芳烃化合物        硝基芳烃化合物是合成许多工业化学物质的重要原料白腐真菌主要降解硝基芳烃化合物是合成许多工业化学物质的重要原料白腐真菌主要降解2,4,6-三三硝基甲苯（硝基甲苯（TNT）和）和2,4-二硝基甲苯。

二硝基甲苯杂环化合物杂环化合物        杂环化合物大多数属于雌性荷尔蒙类物质，对人体危害极大白腐真菌主要降解噻嗯杂环化合物大多数属于雌性荷尔蒙类物质，对人体危害极大白腐真菌主要降解噻嗯类和二恶英类类和二恶英类氰化物氰化物         氰化物是优先污染物，作为氰化物是优先污染物，作为LiP的一种底物，在的一种底物，在H2O2存在时，能被白腐真菌迅速存在时，能被白腐真菌迅速矿化为矿化为CO2杀虫剂杀虫剂      白腐真菌主要降解白腐真菌主要降解DDT和有机磷杀虫剂和有机磷杀虫剂除草剂除草剂       白腐真菌主要降解白腐真菌主要降解2,4,5-三氯苯氧乙酸三氯苯氧乙酸卤化物卤化物         白腐真菌对于有机类卤化物具有脱卤作用白腐真菌对于有机类卤化物具有脱卤作用塑料及聚合物塑料及聚合物        白腐真菌主要降解木素白腐真菌主要降解木素-聚苯乙烯接枝共聚物，聚乙烯塑料和聚酰胺聚苯乙烯接枝共聚物，聚乙烯塑料和聚酰胺挥发性有机物挥发性有机物        白腐真菌对白腐真菌对9种在排放的工业废气中普遍存在的挥发性有机物（种在排放的工业废气中普遍存在的挥发性有机物（VOC）具有降解）具有降解能力。

包括芳烃类（苯、甲苯、乙苯、苯乙烯）、酮类（甲乙基酮、甲基异丁基酮、能力包括芳烃类（苯、甲苯、乙苯、苯乙烯）、酮类（甲乙基酮、甲基异丁基酮、甲基丙酮）、有机酸类（乙酸丁酯、乙基甲基丙酮）、有机酸类（乙酸丁酯、乙基-3-乙氧基乙氧基-丙酸酯）丙酸酯）煤煤        主要是针对低级煤（主要是针对低级煤（LRC），对其进行液化、解聚、聚合和脱色对其进行液化、解聚、聚合和脱色PAH        多环芳烃（多环芳烃（PAH）是重要的环境污染物，危害极大白腐真菌主要降解蒽油、芘、）是重要的环境污染物，危害极大白腐真菌主要降解蒽油、芘、苯并芘、蒽、菲等苯并芘、蒽、菲等PAH类物质染料染料        白腐真菌主要降解偶氮染料、三苯甲烷染料、聚合染料、杂环染料和靛类染料，几白腐真菌主要降解偶氮染料、三苯甲烷染料、聚合染料、杂环染料和靛类染料，几乎包括了染料的所有大类乎包括了染料的所有大类6-5 白腐真菌生物降解的优点白腐真菌生物降解的优点        白腐真菌的生物降解具有其他生物体系，尤其是细菌体系，所不具备的优点，白腐真菌的生物降解具有其他生物体系，尤其是细菌体系，所不具备的优点，共有共有六大优势六大优势。

1、不需要进过特点底物的预条件化；、不需要进过特点底物的预条件化；2、动力学优势；、动力学优势；3、对其他微生物的拮抗；、对其他微生物的拮抗；4、细胞外的降解特征；、细胞外的降解特征；5、降解底物的非特异性；、降解底物的非特异性；6、适用于固液两种体系；、适用于固液两种体系；6-6 白腐真菌生物降解的意义白腐真菌生物降解的意义白腐真菌在碳素循环中的地位和作用白腐真菌在碳素循环中的地位和作用白腐真菌是生物修复的有力工具白腐真菌是生物修复的有力工具白腐真菌在物质转化和资源利用中的应用白腐真菌在物质转化和资源利用中的应用分解作用分解作用光合作用光合作用有机碳有机碳微生物微生物动物动物植物植物死亡死亡死亡死亡生物圈生物圈岩岩石石圈圈埋葬有机碳埋葬有机碳大大气气圈圈/土土壤壤圈圈/水水圈圈CO2呼吸作用呼吸作用CO、、CH2CH4沉积作用沉积作用   CaCO3和和MgCO3矿物染料燃烧矿物染料燃烧   CO2和和CO；岩石风化；岩石风化  CO2碳素循环（生物和地质循环）示意图碳素循环（生物和地质循环）示意图白腐真菌生物技术白腐真菌生物技术白腐真菌生物技术体系白腐真菌生物技术体系基础性技术体系基础性技术体系应用性技术体系应用性技术体系以白腐真菌的生长繁殖、以白腐真菌的生长繁殖、培养保存等为主；以白培养保存等为主；以白腐真菌的生活史为线索腐真菌的生活史为线索以白腐真菌的分离诱变、以白腐真菌的分离诱变、反应体系的建立等为主反应体系的建立等为主以菌的生理生化为线索以菌的生理生化为线索白腐真菌生物技术的特点：白腐真菌生物技术的特点：         1、复杂性：、复杂性：条件的复杂性以及调控和操作的复杂性；条件的复杂性以及调控和操作的复杂性；         2、综合性：、综合性：生物学问题、化学问题和环境问题的结合；生物学问题、化学问题和环境问题的结合；1、白腐真菌培养技术、白腐真菌培养技术白腐真菌生长及保存培养基白腐真菌生长及保存培养基液体培养基液体培养基平板培养基平板培养基试管培养基试管培养基保存培养基保存培养基生长培养基生长培养基几点说明：几点说明：①① 培养基的培养基的pH值，一般保持在值，一般保持在5.5左右；左右；②② 将固体培养基分装在试管里，做成斜将固体培养基分装在试管里，做成斜面，主要供菌种保存用；面，主要供菌种保存用；③③ 将固体培养基倾入培养皿，制作平板，将固体培养基倾入培养皿，制作平板，主要供菌种扩增和获得分生孢子、菌琼脂主要供菌种扩增和获得分生孢子、菌琼脂块等接种物；块等接种物；④④ 不加琼脂，即配制成液体生长培养基，不加琼脂，即配制成液体生长培养基，主要为菌种的扩增和获得收集菌丝体用；主要为菌种的扩增和获得收集菌丝体用；主要培养基种类主要培养基种类PDA培养基培养基这是培养真菌生长的经典固体培养基，全称土豆葡萄糖琼脂培养基这是培养真菌生长的经典固体培养基，全称土豆葡萄糖琼脂培养基（（potato dextrose agar, PDA）。

配方（配方（L-1）：）：200g 土豆浸出液，土豆浸出液，3g KH2PO4 ，，20g 葡萄糖，葡萄糖，20g琼琼脂，脂， 1.5g MgSO4·7H2OMEA培养基培养基这是以麦芽汁为主要成分的固体培养基，全称麦芽琼脂培养基这是以麦芽汁为主要成分的固体培养基，全称麦芽琼脂培养基（（malt extract agar, MEA）配方（配方（ L-1 ）：）：30g 麦芽浸膏，麦芽浸膏，3g 大豆蛋白胨，大豆蛋白胨，15g 琼脂琼脂 MEG培养基培养基配方（配方（ L-1 ）：）：5g 麦芽浸膏，麦芽浸膏，10g 葡萄糖，葡萄糖，10g 琼脂琼脂 YMPG培养基培养基主要由酵母抽提物，麦芽汁，蛋白胨和葡萄糖组成配方（主要由酵母抽提物，麦芽汁，蛋白胨和葡萄糖组成配方（L-1）：）：10g 麦芽汁，麦芽汁，2g 蛋白胨，蛋白胨，2g 酵母抽提物，酵母抽提物，10g 葡萄糖，葡萄糖，20g琼脂，琼脂， 1g MgSO4·7H2O，， 2g KH2PO4 促进白腐真菌生长的天然成分促进白腐真菌生长的天然成分木材、玉米芯、土豆浸出液是目前比较常用的促进白腐真菌生长的天然成分木材、玉米芯、土豆浸出液是目前比较常用的促进白腐真菌生长的天然成分。

菌种的保存菌种的保存菌丝块或孢子菌丝块或孢子室温或室温或28℃或或35 ℃至至39 ℃下培养下培养5 ～～7天，天， -20℃或或4 ℃保存保存孢子孢子混合混合硅胶硅胶密封密封4 ℃保存保存斜面保存斜面保存孢子悬浮液保存孢子悬浮液保存孢子的硅胶保存孢子的硅胶保存孢子孢子-20℃或或4 ℃保存保存无菌蒸馏水无菌蒸馏水接种物的制备接种物的制备孢子悬浮液的制备孢子悬浮液的制备孢子孢子无菌蒸馏水或无菌蒸馏水或0.5%（质量浓度）（质量浓度）的的Tween80溶液溶液培养培养过滤过滤玻璃棉玻璃棉稀释稀释孢子悬浮液孢子悬浮液孢子悬浮液孢子悬浮液浓度测定浓度测定血球计数板计数血球计数板计数（浓度测定的直接方法）（浓度测定的直接方法）分光光度法分光光度法（浓度测定的间接方法）（浓度测定的间接方法）孢子悬浮液制备过程示意图孢子悬浮液制备过程示意图琼脂块琼脂块        主要是那些不形成分生孢子的菌种的接种物主要是那些不形成分生孢子的菌种的接种物        方法：方法：从生长旺盛的平板边缘，切割从生长旺盛的平板边缘，切割0.5～～1.0cm见方的琼脂块见方的琼脂块菌丝体菌丝体菌丝体菌丝体洗涤洗涤研磨混合研磨混合1min取出取出液体培养体系液体培养体系液体培养基液体培养基菌丝体悬浮液菌丝体悬浮液确定生物量确定生物量湿重计算法湿重计算法干重计算法干重计算法菌丝体悬浮液制备方法示意图菌丝体悬浮液制备方法示意图孢子活力的测定孢子活力的测定使用美蓝染色法测定白腐真菌分生孢子的存活率。

使用美蓝染色法测定白腐真菌分生孢子的存活率2、白腐真菌的分离技术、白腐真菌的分离技术2-1 木腐担子菌的分离与筛选木腐担子菌的分离与筛选技术步骤：担子菌筛选技术步骤：担子菌筛选→鉴定菌的木质素降解能力鉴定菌的木质素降解能力技术核心：技术核心：从自然环境的固体介质的混合微生物群体中，将木腐或白腐从自然环境的固体介质的混合微生物群体中，将木腐或白腐                    担子菌分离筛选出来担子菌分离筛选出来基本思路：基本思路：建立选择培养基，在固体的分离培养基中加入一些对其他类建立选择培养基，在固体的分离培养基中加入一些对其他类                    别微生物的抑制剂别微生物的抑制剂基本步骤：基本步骤：担子菌的筛选担子菌的筛选担子菌的纯化担子菌的纯化具体菌种的纯化具体菌种的纯化担子菌的分离担子菌的分离以黄孢原毛平革菌的分离为例以黄孢原毛平革菌的分离为例担子菌的筛选担子菌的筛选利用选择培养基初步分离担子菌类利用选择培养基初步分离担子菌类（粗筛）（粗筛）常用选择培养基配方常用选择培养基配方干燥的麦芽汁提取物干燥的麦芽汁提取物  3.0g真菌蛋白胨真菌蛋白胨  0.5g琼脂琼脂  2.5g蒸馏水蒸馏水  100mL邻苯基苯酚邻苯基苯酚  0.006g注意点：注意点：1、邻苯基苯酚的浓度可以根据具体情况进行调节，最大、邻苯基苯酚的浓度可以根据具体情况进行调节，最大      浓度浓度≤0.01%（质量浓度）；（质量浓度）；2、使用乳酸调节培养基、使用乳酸调节培养基pH值，不影响对担子菌的筛选；值，不影响对担子菌的筛选；优点：优点：      能从受霉菌严重污染的土壤及其他介质中分离担子菌；能从受霉菌严重污染的土壤及其他介质中分离担子菌；真菌耐药性试验真菌耐药性试验细筛细筛        利用担子菌对各类天然和合成杀真菌物质的忍耐性，进一步从筛选利用担子菌对各类天然和合成杀真菌物质的忍耐性，进一步从筛选体系中体系中去除可能残留的细菌和放线菌去除可能残留的细菌和放线菌。

常用的杀真菌物质为玫瑰红（四碘四氯荧光素），一般使用浓度常用的杀真菌物质为玫瑰红（四碘四氯荧光素），一般使用浓度30mg/L担子菌的纯化担子菌的纯化使用苯菌灵使用苯菌灵-麦芽琼脂培养基对培养物进行进一步培养麦芽琼脂培养基对培养物进行进一步培养（纯化）（纯化）纯化的目的：纯化的目的：是要去除培养物中可能存在的其他丝孢菌类（是要去除培养物中可能存在的其他丝孢菌类（hyphomycetes）；）；苯菌灵母液的配制：苯菌灵母液的配制：1g的的50%苯菌灵粉末，加到苯菌灵粉末，加到500mL的蒸馏水中；的蒸馏水中；一般使用浓度与方法：一般使用浓度与方法：将母液按照将母液按照1mg/L的浓度加入的浓度加入2%（质量浓度）的麦芽琼脂培养基中；（质量浓度）的麦芽琼脂培养基中；担子菌的分离担子菌的分离以以Poly R-478为指示剂分离能降解木质素的菌种为指示剂分离能降解木质素的菌种（分离）（分离）常用分离培养基配方常用分离培养基配方大麻茎木大麻茎木  0.2%（质量浓度）（质量浓度）琼脂琼脂  1.5 %（质量浓度）（质量浓度）苯菌灵苯菌灵  15mg/L愈创木酚愈创木酚  0.01 %（质量浓度）（质量浓度）分离分离使用使用0.02%（质量浓度）含（质量浓度）含Poly R-478（聚合染料）的平板麦芽琼脂培养基（聚合染料）的平板麦芽琼脂培养基培养分离菌种培养分离菌种检定检定使愈创木酚变成褐色的菌为目标菌种使愈创木酚变成褐色的菌为目标菌种        使使含含Poly R-478的平板麦芽琼脂的平板麦芽琼脂培养基脱色即可确认分离成功培养基脱色即可确认分离成功具体菌种的纯化具体菌种的纯化        根据需要筛选的特定菌种类型，使用与之匹配的选择性分离培养基，对培养物根据需要筛选的特定菌种类型，使用与之匹配的选择性分离培养基，对培养物反复多次培养，直至获得目标纯菌种，然后采用反复多次培养，直至获得目标纯菌种，然后采用16sRNA检测鉴定。

检测鉴定问题问题假设已经获得某种白腐真菌的子实体，可以采取何种方法分离出纯菌种？假设已经获得某种白腐真菌的子实体，可以采取何种方法分离出纯菌种？培养培养各类真菌子实体各类真菌子实体切割切割获取子实体块获取子实体块PDA培养基培养基植入植入获得菌丝体获得菌丝体菌丝体纯培养菌丝体纯培养2-2  具有降解异生物质能力的白腐真菌的筛选具有降解异生物质能力的白腐真菌的筛选筛选的必要性筛选的必要性        白腐真菌对异生物质的降解长期以来集中在黄孢原毛平革菌，但是在实际应用过程白腐真菌对异生物质的降解长期以来集中在黄孢原毛平革菌，但是在实际应用过程中其木质素降解条件很难得到满足因此，筛选能在较宽泛环境条件下降解异生物质的中其木质素降解条件很难得到满足因此，筛选能在较宽泛环境条件下降解异生物质的白腐真菌对于应用技术的开发具有重要意义白腐真菌对于应用技术的开发具有重要意义筛选的基本策略筛选的基本策略        理想的筛选方法，既要便宜，建立在相对无毒的底物基础上，不依赖于烦琐的分析理想的筛选方法，既要便宜，建立在相对无毒的底物基础上，不依赖于烦琐的分析之上，同时它应该与木质素降解酶所调节的异生物质的降解有高度的相对应性。

之上，同时它应该与木质素降解酶所调节的异生物质的降解有高度的相对应性利用聚合染料的筛选程序（常用）利用聚合染料的筛选程序（常用）指示染料的选择指示染料的选择选择培养基选择培养基异生物质的降解与染料脱色相关性判断异生物质的降解与染料脱色相关性判断2-3  白腐真菌木质素降解性能的鉴定白腐真菌木质素降解性能的鉴定白腐真菌木质素降解酶的平板定性白腐真菌木质素降解酶的平板定性方法一方法一Poly R-478指示细胞外氧化酶指示细胞外氧化酶       在平板上补充在平板上补充0.02%（质量浓度）（质量浓度） Poly R-478，用于检测细胞外氧化酶现象：平板脱色，用于检测细胞外氧化酶现象：平板脱色方法二方法二平板系统定性测试木质素降解酶平板系统定性测试木质素降解酶加入加入250mg/L的的ABTS，菌丝周围形成黑绿色环，，菌丝周围形成黑绿色环，指示指示Lac和过氧化物酶存在和过氧化物酶存在加入加入0.1g/L的的MnCl2·4H2O，平板上形成黑棕色斑，平板上形成黑棕色斑点，指示点，指示MnP的合成的合成平板测试系统平板测试系统agar-plate test system25g/L琼脂琼脂35mL接种直径接种直径10mm的琼脂菌丝块的琼脂菌丝块ABTS-平板平板Mn-平板平板腐殖酸腐殖酸-平板平板加入加入1g/L的煤腐殖酸，平板上发生漂白反应，指的煤腐殖酸，平板上发生漂白反应，指示木质素降解酶的系统的存在示木质素降解酶的系统的存在白腐真菌木质素降解能力的平板鉴定白腐真菌木质素降解能力的平板鉴定这是一种快速评价白腐真菌木质素降解能力的平板方法。

这是一种快速评价白腐真菌木质素降解能力的平板方法经典培养基经典培养基PDA培养基培养基去除土豆滤液去除土豆滤液基本琼脂培养基基本琼脂培养基BAM培养基培养基ABTS-琼脂培养基琼脂培养基SYR-琼脂培养基琼脂培养基Mn-琼脂培养基琼脂培养基加入加入100mg/L的的ABTS加入加入100mg/L的的MnCl2·4H2O加入加入100mg/L的的丁香连氮（吖嗪）丁香连氮（吖嗪）加入加入10mL的各培养基，并植入的各培养基，并植入5mm的琼脂菌丝块，每的琼脂菌丝块，每2～～3日检测色变区和菌的放射性生长日检测色变区和菌的放射性生长菌丝周围形成深绿色菌丝周围形成深绿色1周后在菌丝周围积累周后在菌丝周围积累紫色醌类物紫色醌类物2周后形成黑棕色的周后形成黑棕色的MnO2条纹条纹3、白腐真菌反应体系的建立、白腐真菌反应体系的建立白白腐腐真真菌菌反反应应体体系系的的种种类类平板反应体系平板反应体系液体反应体系液体反应体系静置反应体系静置反应体系摇床反应体系摇床反应体系主要用于酶和降解的定性研究主要用于酶和降解的定性研究        主要用于酶学研究和降解主要用于酶学研究和降解反应的定性定量研究反应的定性定量研究建立白腐真菌反应体系需要考虑的基本因素（建立白腐真菌反应体系需要考虑的基本因素（6大因素）大因素）培养基培养基经典培养基的组成（经典培养基的组成（L-1））0.2g KH2PO40.05g MgSO4·7H2O0.01g CaCl21mL 无机溶液无机溶液0.5mL 维生素溶液维生素溶液1.2mmoL 酒石酸铵（氮源）酒石酸铵（氮源）56mmoL 葡萄糖（碳源）葡萄糖（碳源）20mmoL DMS（缓冲成分）（缓冲成分）pH 4.5维生素溶液（维生素溶液（ L-1 ））2mg 生物素生物素2mg 叶酸叶酸5mg 维生素维生素B15mg 烟酸烟酸5mg 维生素维生素B210mg 维生素维生素B6盐酸盐盐酸盐0.1mg 维生素维生素B125mg DL-泛酸钙泛酸钙5mg 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸5mg 硫辛酸硫辛酸无机溶液（无机溶液（ L-1 ））1.5g 氨基三乙酸酯氨基三乙酸酯3g MgSO4·7H2O0.5g MnSO41g NaCl2100mg FeSO4·7H2O100mg CoSO482mg CaCl2100mg ZnSO4100mg CuSO4·5H2O10mg AlK(SO4)210mg H3BO310mg NaMoO4        为防止培养基的微生物污染可以考虑在培养基分装前或是培养为防止培养基的微生物污染可以考虑在培养基分装前或是培养5天后加入天后加入20U/mL青霉素或是青霉素或是2mg/mL链霉素，不会影响木质素过氧化物酶的产生。

链霉素，不会影响木质素过氧化物酶的产生活性成分活性成分反应温度反应温度底物加入时间底物加入时间接种方式及接种量接种方式及接种量VA 主要提高主要提高LiP的产量和活性；的产量和活性；Mn(Ⅱ) 主要提高主要提高MnP的产量和活性；的产量和活性；Cu (Ⅱ)和小分子芳烃化合物和小分子芳烃化合物主主要提高主主要提高Lac的产量和活性；的产量和活性；表面活性剂表面活性剂 保护酶的活性，提高对降解底物的利用性；保护酶的活性，提高对降解底物的利用性；主要有两种反应温度，主要有两种反应温度，28 ℃以上以上39 ℃以下以下和和25 ℃以上以上28 ℃以下以下；；一般选择在接种以后的第一般选择在接种以后的第6天，防止底物毒性抑制孢子的萌发，菌丝体的生长以及酶的合成及活性等；天，防止底物毒性抑制孢子的萌发，菌丝体的生长以及酶的合成及活性等；选择孢子悬浮液或是菌丝块，严格按照一定比例定量添加；选择孢子悬浮液或是菌丝块，严格按照一定比例定量添加；供氧供氧供供氧氧方方式式（（主主要要针针对对液液体体反反应应体体系系））人工通气人工通气自然地复氧作用自然地复氧作用用通气装置或通气管，直接将空气或纯氧导入反应体系。

用通气装置或通气管，直接将空气或纯氧导入反应体系一般间隔一般间隔3天进行氧的补充天进行氧的补充培养体系自身培养体系自身与环境进行气与环境进行气体的交换和氧体的交换和氧气的补充气的补充静置培养静置培养摇床培养摇床培养采用浅层培养的方式三角烧瓶装液量一般规律：采用浅层培养的方式三角烧瓶装液量一般规律：10mL/125mL, 20mL/250mL, 50mL/500mL摇床转速一般为摇床转速一般为100～～200r/min优点优点：加大了氧气的传输和传质效率；：加大了氧气的传输和传质效率；缺点缺点：机械剪切力破坏酶结构与活性；：机械剪切力破坏酶结构与活性；解决途径解决途径：一是加入表面活性剂，二是将孢子、菌丝体：一是加入表面活性剂，二是将孢子、菌丝体                    或酶固定化；或酶固定化；4、白腐真菌的固定化（、白腐真菌的固定化（immobilizayion）技术）技术白白腐腐真真菌菌固固定定化化技技术术的的类类型型共固定共固定吸附法吸附法包埋法包埋法琼脂糖和琼脂小珠琼脂糖和琼脂小珠海藻酸钙小珠海藻酸钙小珠K-卡拉胶颗粒卡拉胶颗粒明胶包埋小块明胶包埋小块PVA包埋法包埋法多孔的聚合物多孔的聚合物聚氨酯泡沫小块聚氨酯泡沫小块多孔的聚氨酯颗粒多孔的聚氨酯颗粒植物纤维编织绳植物纤维编织绳多孔陶瓷载体多孔陶瓷载体烧结玻璃载体烧结玻璃载体琼脂糖和琼脂小珠琼脂糖和琼脂小珠包埋法包埋法细胞或酶的包埋是生物固定化中细胞或酶的包埋是生物固定化中最常用的方法最常用的方法。

基本原理基本原理是将生物材料包裹和埋藏在水不溶性的凝胶聚合物的网络骨架中是将生物材料包裹和埋藏在水不溶性的凝胶聚合物的网络骨架中用于包埋的凝胶聚合物，分为用于包埋的凝胶聚合物，分为天然的高分子多糖类物质天然的高分子多糖类物质和和合成的高分子化合物合成的高分子化合物两大类将白腐真菌的孢子包埋于琼脂糖胶和琼脂胶小珠内，制备方法如下：将白腐真菌的孢子包埋于琼脂糖胶和琼脂胶小珠内，制备方法如下：孢子悬浮液的制备孢子悬浮液的制备要求孢子浓度达到要求孢子浓度达到107数量级每毫升数量级每毫升配制配制2.5%（质量浓度）的（质量浓度）的琼脂糖或琼脂水溶液琼脂糖或琼脂水溶液灭菌灭菌20分钟分钟冷却至冷却至45℃1000mL琼脂糖或琼脂水溶液琼脂糖或琼脂水溶液加入加入1mL混合混合已灭菌并冷却至已灭菌并冷却至45℃的葵花油的葵花油45g加入加入混合混合浸入冰水冷却，继续混合浸入冰水冷却，继续混合30分钟分钟无菌水洗涤至无油无菌水洗涤至无油海藻酸钙小珠海藻酸钙小珠方法一方法一2g 海藻酸钠海藻酸钠溶解溶解60mL蒸馏水蒸馏水海藻酸钠水溶液海藻酸钠水溶液108℃，，10分钟分钟150mg干重的鲜菌团干重的鲜菌团过滤、研磨过滤、研磨40mL蒸馏水蒸馏水（无菌）（无菌）菌的细胞悬浮液菌的细胞悬浮液2%（质量浓度）（质量浓度）海藻酸盐溶液海藻酸盐溶液2%（质量浓度）（质量浓度）CaCl2溶液溶液50mL滴入滴入2h硬化硬化海藻酸钙小珠海藻酸钙小珠多次洗涤多次洗涤方法二方法二2g 琼脂和琼脂和0.75g海藻酸钠海藻酸钠溶解溶解60mL蒸馏水蒸馏水海藻酸钠水溶液海藻酸钠水溶液108℃，，10分钟分钟150mg干重的鲜菌团干重的鲜菌团过滤、研磨过滤、研磨40mL蒸馏水蒸馏水（无菌）（无菌）菌的细胞悬浮液菌的细胞悬浮液2%（质量浓度）（质量浓度）海藻酸盐溶液海藻酸盐溶液2.5%（质量浓度）（质量浓度）CaCl2溶液溶液50mL10mL针筒，滴入针筒，滴入海藻酸钙小珠海藻酸钙小珠多次洗涤多次洗涤形成小珠形成小珠转入转入磷酸缓冲溶液磷酸缓冲溶液1.460%K2HPO40.226%KH2PO4K-卡拉胶颗粒卡拉胶颗粒2g K-卡拉胶卡拉胶溶解溶解60mL蒸馏水蒸馏水海藻酸钠水溶液海藻酸钠水溶液108℃，，10分钟分钟150mg干重的鲜菌团干重的鲜菌团过滤、研磨过滤、研磨40mL蒸馏水蒸馏水（无菌）（无菌）菌的细胞悬浮液菌的细胞悬浮液2%（质量浓度）（质量浓度）海藻酸盐溶液海藻酸盐溶液2%（质量浓度）（质量浓度）KCl溶液溶液50mL滴入滴入2h硬化硬化K-卡拉胶小珠卡拉胶小珠多次洗涤多次洗涤K-卡拉胶颗粒常规制备方法卡拉胶颗粒常规制备方法条件优化与改进：条件优化与改进：         以生理盐水为溶剂，卡拉胶浓度为以生理盐水为溶剂，卡拉胶浓度为3%（质量浓度），常规菌量的（质量浓度），常规菌量的1/2，，在在2%（质量浓度）的（质量浓度）的KCl溶液中交联溶液中交联2h，切成小块。

切成小块明胶包埋小块明胶包埋小块含含6.25g干重细胞的干重细胞的细胞悬浮液细胞悬浮液25mL10mL的的20%（质量（质量浓度）明胶浓度）明胶10mL的的1.875%（质（质量浓度）海藻酸钠量浓度）海藻酸钠40℃混合混合冷却至冷却至5℃软胶软胶硬胶硬胶浸入浸入40g/L CaCl2切割切割2mm明胶小块明胶小块0.05mol/L磷酸钾缓冲液（磷酸钾缓冲液（pH7.6））洗涤，使海藻酸钙洗涤，使海藻酸钙-明胶复合物明胶复合物中海藻酸盐漏出，直至洗涤干净中海藻酸盐漏出，直至洗涤干净海藻酸钙海藻酸钙-明胶复合物明胶复合物使用使用0.01mol/L的戊二醛的戊二醛（（0.05mol/L磷酸钾缓冲液）磷酸钾缓冲液）对多孔团块进行交联对多孔团块进行交联1h（（ pH7.6 ））无菌蒸馏水洗涤无菌蒸馏水洗涤PVA包埋法包埋法PVA，聚乙烯醇，相对分子质量，聚乙烯醇，相对分子质量77000～～79000，为人工合成的高分子化合物为人工合成的高分子化合物PVA包埋最常用的是包埋最常用的是PVA-硼酸法硼酸法浓缩的孢子（菌体）悬浮液浓缩的孢子（菌体）悬浮液含含13% PVA和和0.02%海藻酸钠（质量浓度）海藻酸钠（质量浓度）水溶液，水溶液，60℃冷却至冷却至35℃混合，滴入含有混合，滴入含有2%CaCl2的饱和硼酸中的饱和硼酸中在溶液中硬化在溶液中硬化24小时小时无菌蒸馏水洗涤无菌蒸馏水洗涤直径直径3mm的的PVA固定化小珠（约固定化小珠（约10%PVA，约，约10%活菌体细胞或孢子）活菌体细胞或孢子）白腐真菌包埋技术初探白腐真菌包埋技术初探环本环本环本环本053      053      姚晶晶姚晶晶姚晶晶姚晶晶－研究背景－－研究背景－u白腐真菌处理有机固体废物时存在问题，白腐真菌处理有机固体废物时存在问题，即即 降解效率低降解效率低 ，产生机械剪切力，产生机械剪切力u白腐真菌包埋技术能解决问题，防止机械剪白腐真菌包埋技术能解决问题，防止机械剪 切力的产生切力的产生－目的－－目的－ 通过对白腐真菌菌剂的复活率、保存效果和通过对白腐真菌菌剂的复活率、保存效果和通过对白腐真菌菌剂的复活率、保存效果和通过对白腐真菌菌剂的复活率、保存效果和制备成本的比较来选择制备白腐真菌菌剂的优势制备成本的比较来选择制备白腐真菌菌剂的优势制备成本的比较来选择制备白腐真菌菌剂的优势制备成本的比较来选择制备白腐真菌菌剂的优势载体。

载体 为白腐真菌处理有机固体废物时减少杂菌感为白腐真菌处理有机固体废物时减少杂菌感为白腐真菌处理有机固体废物时减少杂菌感为白腐真菌处理有机固体废物时减少杂菌感染率染率染率染率, , , ,寻求一种最佳的白腐真菌包埋手段寻求一种最佳的白腐真菌包埋手段寻求一种最佳的白腐真菌包埋手段寻求一种最佳的白腐真菌包埋手段 l实验用微生物菌种实验用微生物菌种实验用微生物菌种实验用微生物菌种ØØ香菇（香菇（香菇（香菇（LentinusLentinus edodes edodes）：）：）：）：          购自浙江省庆元县食用菌科研中心购自浙江省庆元县食用菌科研中心购自浙江省庆元县食用菌科研中心购自浙江省庆元县食用菌科研中心ØØ黄孢原毛平革菌（黄孢原毛平革菌（黄孢原毛平革菌（黄孢原毛平革菌（Phanerochaete Phanerochaete chrysosporiumchrysosporium）：）：）：）： 购自中科院微生物菌种保藏中心购自中科院微生物菌种保藏中心购自中科院微生物菌种保藏中心购自中科院微生物菌种保藏中心ØØ凤尾菇（凤尾菇（凤尾菇（凤尾菇（PleurotusPleurotus pulmononanuspulmononanus）：）：）：）：            购自浙江省庆元县食用菌科研中心购自浙江省庆元县食用菌科研中心购自浙江省庆元县食用菌科研中心购自浙江省庆元县食用菌科研中心ØØ平菇平菇平菇平菇   （（（（PleurotusPleurotus ostreatusostreatus）：）：）：）：            购自浙江省庆元县食用菌科研中心购自浙江省庆元县食用菌科研中心购自浙江省庆元县食用菌科研中心购自浙江省庆元县食用菌科研中心纯培养的白腐真菌菌丝体纯培养的白腐真菌菌丝体纯培养的白腐真菌菌丝体纯培养的白腐真菌菌丝体－－结果及分析结果及分析－－白腐真菌菌剂的感观白腐真菌菌剂的感观 四种白腐真菌菌剂的外观形态四种白腐真菌菌剂的外观形态四种白腐真菌菌剂的外观形态四种白腐真菌菌剂的外观形态                  PVAPVA包埋小珠色泽透明、弹性度强是最优选菌剂，包埋小珠色泽透明、弹性度强是最优选菌剂，包埋小珠色泽透明、弹性度强是最优选菌剂，包埋小珠色泽透明、弹性度强是最优选菌剂，K—K—卡拉胶包埋卡拉胶包埋卡拉胶包埋卡拉胶包埋小珠湿度较大处于劣势地位。

小珠湿度较大处于劣势地位小珠湿度较大处于劣势地位小珠湿度较大处于劣势地位l白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌        用用PVA对黄孢原毛平革菌进行包埋在本次实对黄孢原毛平革菌进行包埋在本次实验中复活率最快，生长更浓密验中复活率最快，生长更浓密l l白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况香菇香菇香菇香菇              香菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋法和香菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋法和香菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋法和香菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋法和PVAPVA小珠小珠小珠小珠包埋法包埋法包埋法包埋法l白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况 凤尾菇凤尾菇凤尾菇凤尾菇                凤尾菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋法和凤尾菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋法和凤尾菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋法和凤尾菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋法和PVAPVA小珠包埋法小珠包埋法小珠包埋法小珠包埋法l白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况 平菇平菇平菇平菇              平菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋方法、平菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋方法、平菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋方法、平菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋方法、PVAPVA小珠包埋法、明胶小珠包埋法和小珠包埋法、明胶小珠包埋法和小珠包埋法、明胶小珠包埋法和小珠包埋法、明胶小珠包埋法和K—K—卡拉胶小珠包卡拉胶小珠包卡拉胶小珠包卡拉胶小珠包埋法。

埋法K—卡拉胶卡拉胶 PVA 明胶明胶钠酸藻海钠酸藻海白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果          感观变化（感观变化（感观变化（感观变化（3030天）天）天）天）K—卡拉胶包埋小珠的湿度变大，保存效果较差卡拉胶包埋小珠的湿度变大，保存效果较差l l白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果复活率复活率复活率复活率————黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌 四种包埋小珠的复活率不随着保存时间的延长而下降四种包埋小珠的复活率不随着保存时间的延长而下降菌菌丝丝体体生生长长长长度度（（ cm ））培养时间（培养时间（d））l l白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果复活率复活率复活率复活率——香菇香菇香菇香菇 四种包埋小珠的复活率不随着保存时间的延长而下降四种包埋小珠的复活率不随着保存时间的延长而下降菌菌丝丝体体生生长长长长度度 （（ cm ）） 培养时间（培养时间（d））l l白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果复活率复活率复活率复活率——凤尾菇凤尾菇凤尾菇凤尾菇 四种包埋小珠的复活率不随着保存时间的延长而下降。

四种包埋小珠的复活率不随着保存时间的延长而下降菌菌丝丝体体生生长长长长度度（（ cm ）） 培养时间（培养时间（d））l l白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果白腐真菌菌剂的保存效果复活率复活率复活率复活率——平菇平菇平菇平菇         K—卡拉胶包埋小珠的复活率随着保存时间的延卡拉胶包埋小珠的复活率随着保存时间的延长而下降长而下降菌菌丝丝体体生生长长长长度度（（ cm ））培养时间（培养时间（d））规格规格规格规格海藻酸钠（元）海藻酸钠（元）海藻酸钠（元）海藻酸钠（元） 聚乙烯醇（元）聚乙烯醇（元）聚乙烯醇（元）聚乙烯醇（元） 明胶（元）明胶（元）明胶（元）明胶（元）K-K-卡拉胶（元）卡拉胶（元）卡拉胶（元）卡拉胶（元）材料（材料（材料（材料（1g1g））））本次实验材料本次实验材料本次实验材料本次实验材料0.160.160.320.32     0.08     0.08     0.36     0.360.1280.1280.380.380.40.40.80.8四种材料的制备成本比较四种材料的制备成本比较制备成本分析制备成本分析        本实验包埋本实验包埋150mg干重的白腐真菌所需的海藻酸钠和干重的白腐真菌所需的海藻酸钠和K-卡拉胶各需卡拉胶各需2g，明胶，明胶3g，聚乙烯醇（，聚乙烯醇（PVA））3.8g，此外，此外PVA包埋时为防止粘交，要包埋时为防止粘交，要加入加入0.38g海藻酸钠。

海藻酸钠     海藻酸钠小珠包埋法是最便宜实惠的包埋方法，海藻酸钠小珠包埋法是最便宜实惠的包埋方法，PVA包埋法次之，包埋法次之，K-卡拉胶包埋法是这四种包埋法中花费最多卡拉胶包埋法是这四种包埋法中花费最多                   本研究结果证明：本研究结果证明：最适合白腐真菌包埋的方法是最适合白腐真菌包埋的方法是最适合白腐真菌包埋的方法是最适合白腐真菌包埋的方法是海藻酸钠小珠包埋法和海藻酸钠小珠包埋法和海藻酸钠小珠包埋法和海藻酸钠小珠包埋法和PVAPVA小珠包埋法小珠包埋法小珠包埋法小珠包埋法                综合结果表明：综合结果表明：在白腐真菌处理有机固体废物时，在白腐真菌处理有机固体废物时，在白腐真菌处理有机固体废物时，在白腐真菌处理有机固体废物时，海藻酸钠小珠包埋法是最适合选择海藻酸钠小珠包埋法是最适合选择海藻酸钠小珠包埋法是最适合选择海藻酸钠小珠包埋法是最适合选择－总结－－总结－吸附法吸附法        利用微生物和载体（利用微生物和载体（support）之间的吸附能力，将微生物结合在载体表面，形成）之间的吸附能力，将微生物结合在载体表面，形成微生物微生物-载体复合物，这种固定方法称为吸附法（载体复合物，这种固定方法称为吸附法（adsorption）；）；        常见载体包括：尼龙网、聚氨酯泡沫、硅管、烧结玻璃、多孔陶瓷、聚丙烯等，其常见载体包括：尼龙网、聚氨酯泡沫、硅管、烧结玻璃、多孔陶瓷、聚丙烯等，其中尼龙网、聚氨酯泡沫、硅管、烧结玻璃较为常用；中尼龙网、聚氨酯泡沫、硅管、烧结玻璃较为常用；聚氨酯泡沫小块聚氨酯泡沫小块1cm3的聚氨酯泡沫小块，用无菌蒸馏水洗涤的聚氨酯泡沫小块，用无菌蒸馏水洗涤3次次加入加入600mL蒸馏水加蒸馏水加45块聚氨酯泡沫，灭菌块聚氨酯泡沫，灭菌无菌条件下过滤后，加入无菌条件下过滤后，加入600mL培养基培养基接种孢子悬浮液进行培养接种孢子悬浮液进行培养最终要求孢子悬浮液浓度达到最终要求孢子悬浮液浓度达到2.5×105个个/mL植物纤维编织绳植物纤维编织绳        选用的植物编织绳可以是棉绳、麻绳、草绳，长短粗细可以根据实际需要进行调整选择，其中选用的植物编织绳可以是棉绳、麻绳、草绳，长短粗细可以根据实际需要进行调整选择，其中一般选择草绳可以获得较好的实际应用效果。

一般选择草绳可以获得较好的实际应用效果制备过程：制备过程：        选择好的材料在质量浓度为选择好的材料在质量浓度为1%的葡萄糖水溶液的葡萄糖水溶液100mL中浸泡中浸泡2h，在补充，在补充10mL质量浓度为质量浓度为1%的的葡萄糖水溶液后灭菌然后再混合体系中接入菌丝体，合适温度下培养葡萄糖水溶液后灭菌然后再混合体系中接入菌丝体，合适温度下培养1～～2周，保证材料中均长满菌周，保证材料中均长满菌丝体烧结玻璃载体烧结玻璃载体        利用玻璃粉在有空前体物存在的情况下进行烧结加工，制备多孔玻璃载体然后将玻璃载体放置利用玻璃粉在有空前体物存在的情况下进行烧结加工，制备多孔玻璃载体然后将玻璃载体放置于孢子悬浮液中培养，固定菌丝体于孢子悬浮液中培养，固定菌丝体优点：在优点：在600℃条件下焚烧后可以重复使用；类似的载体还有烧结陶瓷条件下焚烧后可以重复使用；类似的载体还有烧结陶瓷共固定共固定        共固定是固定化技术的新发展它是将各种酶、微生物细胞和底物，共同固定在一个综合体系中，共固定是固定化技术的新发展它是将各种酶、微生物细胞和底物，共同固定在一个综合体系中，实现酶促反应和新陈代谢的共同作用或相互反应。

实现酶促反应和新陈代谢的共同作用或相互反应        共固定的共固定的优点优点在于建立了一个综合工艺：在于建立了一个综合工艺：①① 将关键生物共同固定在一个特定体系中，避免过剩性将关键生物共同固定在一个特定体系中，避免过剩性或抑制性的生物转化；或抑制性的生物转化；②② 使在催化功能上有联系的生物物种在空间上接近，导致了高产率使在催化功能上有联系的生物物种在空间上接近，导致了高产率         共固定的方法，可以通过吸附、包埋和胶囊化等，将多种生物催化剂固定在同一反应体系中应共固定的方法，可以通过吸附、包埋和胶囊化等，将多种生物催化剂固定在同一反应体系中应选择表现出种间共生、偏利共生或互惠共生的种，进行固定混合培养选择表现出种间共生、偏利共生或互惠共生的种，进行固定混合培养白腐真菌在环境保护中的作用白腐真菌在环境保护中的作用1、白腐真菌和水污染控制、白腐真菌和水污染控制白腐真菌应用于污染处理的最初和最多的实践，是在水污染控制领域白腐真菌应用于污染处理的最初和最多的实践，是在水污染控制领域制浆造纸废水处理制浆造纸废水处理废水特点：废水特点：含有大量木质素和氯化木质素的难降解化学物质以及大量色素类成分，含有大量木质素和氯化木质素的难降解化学物质以及大量色素类成分，                    导致了废水的高色度和难降解性。

导致了废水的高色度和难降解性处理原理：处理原理：利用白腐真菌对木质纤维素类物质的降解能力，同时利用白腐真菌作用利用白腐真菌对木质纤维素类物质的降解能力，同时利用白腐真菌作用                     所导致的废水脱色反应所导致的废水脱色反应        木质素及其降解衍生物是废水的主要致色成分，脱色的本质是由于白腐真菌对木质素及其降解衍生物是废水的主要致色成分，脱色的本质是由于白腐真菌对木质素及相关化合物代谢的结果木质素及相关化合物代谢的结果纸浆造纸废水纸浆造纸废水沉淀池沉淀池生物反应器生物反应器RBC澄清池澄清池达标出水达标出水剩余污泥剩余污泥制浆造纸废水一般处理工艺制浆造纸废水一般处理工艺1、整个工艺以、整个工艺以RBC生物反应器为基础，不需要无菌条件；生物反应器为基础，不需要无菌条件；2、工艺产生的剩余污泥，富含纤维素、矿物质和氮源物质可以作为培养白腐真菌的营养物；、工艺产生的剩余污泥，富含纤维素、矿物质和氮源物质可以作为培养白腐真菌的营养物；橄榄油生产废水处理橄榄油生产废水处理废水特点：废水特点：黑色、高毒性，含高浓度芳烃类化合物以及大量多酚类物质，具有植物毒性和黑色、高毒性，含高浓度芳烃类化合物以及大量多酚类物质，具有植物毒性和                     抗菌作用，常规微生物无法处理。

抗菌作用，常规微生物无法处理处理原理：处理原理：利用白腐真菌对化学物质降解的广谱性利用白腐真菌对化学物质降解的广谱性橄榄油生产废水一般处理工艺橄榄油生产废水一般处理工艺以活性污泥法为基础的处理工艺以活性污泥法为基础的处理工艺军火工业废水处理军火工业废水处理废水特点：废水特点：红色、高毒性，含高浓度硝基芳烃类化合物发生光化学反应而产生红色、高毒性，含高浓度硝基芳烃类化合物发生光化学反应而产生处理原理：处理原理：利用白腐真菌对硝基芳烃类化合物降解作用利用白腐真菌对硝基芳烃类化合物降解作用军火工业废水一般处理工艺（生物军火工业废水一般处理工艺（生物-活性炭工艺）活性炭工艺）（（1）预处理；（）预处理；（2）生物处理；（）生物处理；（3）泥水分离；（）泥水分离；（4）污泥处理；（）污泥处理；（5）过滤）过滤工业有机废水处理工业有机废水处理废水特点：废水特点：色度高，含高浓度各类有机化合物以及少量木质纤维类物质色度高，含高浓度各类有机化合物以及少量木质纤维类物质处理原理：处理原理：利用白腐真菌对化学物质降解的广谱性以及对木质纤维类物质的降解作用利用白腐真菌对化学物质降解的广谱性以及对木质纤维类物质的降解作用。

工业有机废水一般处理工艺工业有机废水一般处理工艺以活性污泥法为基础的处理工艺以活性污泥法为基础的处理工艺白腐真菌处理废水过程中常用生物反应器简介白腐真菌处理废水过程中常用生物反应器简介1、生物反应器、生物反应器RBC四联装生物反应器四联装生物反应器RBC一个反应单元，就可以单独进行白腐真菌生物处理一个反应单元，就可以单独进行白腐真菌生物处理生物转盘，生物转盘，RBC生物反应器的核心结构，由多片生物反应器的核心结构，由多片生物转盘组合而成一般采用的是聚（甲基生物转盘组合而成一般采用的是聚（甲基-甲基甲基丙烯酯）材料丙烯酯）材料面壁构成水槽，污水在水槽中流动，与生物转盘不断接面壁构成水槽，污水在水槽中流动，与生物转盘不断接触；由生物转盘的转动，带动液体与空气的接触，从而触；由生物转盘的转动，带动液体与空气的接触，从而保证氧气的供应保证氧气的供应出水口出水口进水口进水口2、池型生物反应器、池型生物反应器回流泵回流泵空气泵空气泵侧视图侧视图俯视图俯视图复合载体复合载体复合载体一般为不锈钢钢丝网复合载体一般为不锈钢钢丝网夹生物海绵制成，用于固定白夹生物海绵制成，用于固定白腐真菌2、白腐真菌和土壤污染控制、白腐真菌和土壤污染控制　　运用白腐真菌进行土壤污染控制，属于土壤污染生物修复的范畴，其最大的特点就是　　运用白腐真菌进行土壤污染控制，属于土壤污染生物修复的范畴，其最大的特点就是可以实现原位生物修复．可以实现原位生物修复．处理原理：处理原理：利用白腐真菌对化学物质降解的广谱性。

利用白腐真菌对化学物质降解的广谱性　　目前可以运用白腐真菌进行修复的受污染土壤包括以下类型：　　目前可以运用白腐真菌进行修复的受污染土壤包括以下类型： PCP污染土壤；污染土壤；PAH污染土壤；污染土壤；PCB污染土壤污染土壤；焦油污染土壤；杂酚油污染土壤；；焦油污染土壤；杂酚油污染土壤；石油污染土壤石油污染土壤；；一般处理工艺一般处理工艺1、接种材料的制备、接种材料的制备      接种材料主要使用菌孢子悬浮液和采用吸附法固定于木质纤维类材料上的固定化菌种；接种材料主要使用菌孢子悬浮液和采用吸附法固定于木质纤维类材料上的固定化菌种；2、工程实施规划、工程实施规划       主要对实施范围、深度以及防止生物扩散的措施进行规划；主要对实施范围、深度以及防止生物扩散的措施进行规划；3、过程效果检测、过程效果检测      主要是检测处理对象污染物的浓度变化；主要是检测处理对象污染物的浓度变化；3、白腐真菌和大气污染控制、白腐真菌和大气污染控制白腐真菌处理大气污染主要是处理工业活动和废物处理过程中排放的挥发性有机化合物白腐真菌处理大气污染主要是处理工业活动和废物处理过程中排放的挥发性有机化合物.采用的常见方法采用的常见方法        微生物吸收法（微生物吸收法（Microorganism Absorption））        原理：利用微生物、营养物和水组成的吸收液处理废气，适合于处理可溶性的气态污染物。

原理：利用微生物、营养物和水组成的吸收液处理废气，适合于处理可溶性的气态污染物         装置：由吸收器（物理溶解过程）和废水反应器（生物处理过程）两部分组成装置：由吸收器（物理溶解过程）和废水反应器（生物处理过程）两部分组成        微生物洗涤法（微生物洗涤法（Microorganism Wash））        利用混合液作为吸收剂处理废气，对脱除复合型臭气效果较好利用混合液作为吸收剂处理废气，对脱除复合型臭气效果较好        微生物过滤法（微生物过滤法（Microorganism Adsorption））        利用含有微生物的固体颗粒吸收废气中的污染物主要使用微生物过滤箱利用含有微生物的固体颗粒吸收废气中的污染物主要使用微生物过滤箱4、白腐真菌和重金属污染、白腐真菌和重金属污染白腐真菌处理重金属污染主要是利用菌体的吸附作用和吸收作用白腐真菌处理重金属污染主要是利用菌体的吸附作用和吸收作用图图 吸收设备－填料塔吸收设备－填料塔5、白腐真菌和有机固体废物资源化、白腐真菌和有机固体废物资源化。