SOX4单克隆抗体的制备.doc

眉题 2 SOX4单克隆抗体的制备及其在肿瘤细胞表达分析中的应用于鸣1, 穆蕊2, 吕明1, 李爱玲2, 郭宁11 军事医学科学院基础医学研究所 细胞免疫学研究室, 北京 1008502 国家生物医学分析中心, 北京 100850摘 要: 应用分子生物学技术, 构建了含SOX4编码序列的原核表达载体, 在大肠杆菌 DH5a中获得了GST-SOX4融合蛋白的可溶性表达应用谷胱甘肽-Sepharose 4B对重组蛋白进行了纯化, 利用纯化的融合蛋白免疫小鼠, 制备了可特异性识别SOX4的单克隆抗体通过间接 ELISA 法鉴定了抗体的效价为1 × 10-5, Western blotting 分析证实了抗体的特异性结果显示, 该抗体可识别细胞内外源性过表达及内源性的SOX4蛋白在培养细胞系、小鼠不同组织中, SOX4蛋白的表达存在显著的差异本研究制备的SOX4单克隆抗体具有良好的特异性, 为进一步研究SOX4在肿瘤发生中的作用提供了重要的工具关键词: SOX4, 融合蛋白, 单克隆抗体, 肿瘤发生Preparation of the monoclonal antibody against SOX4protein and detection of SOX4 expression level indifferent tumor cell linesMing Yu1, Rui Mu2, Ming Lü1, Ailing Li2, and Ning Guo11 Department of Molecular Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China2 National Center of Biomedical Analysis, Beijing 100850, ChinaAbstract: In the present study, we constructed a prokaryotic expression vector containing SOX4 protein encoding sequences. The GST-SOX4 soluble protein was expressed in Escherichia coli DH5a and purified by glutathione sepharose-4B. The purified recombinant protein was used to immunize Balb/C mice and the monoclonal antibody against SOX4 was prepared by using hybridoma technique. The titer of the antibody was determined as 1×10-5 by indirect ELISA. The specificity of the antibody was verified by Western blotting analysis. The monoclonal antibody specifically recognized the overexpressed exogenous SOX4 protein as well as endogenous SOX4 protein. The expression level of SOX4 protein in different cell lines and mouse tissues was detected by using the antibody. Differential expression of the protein was demonstrated by Western blotting. The data indicated that the antibody was specific. The antibody can be used as an important tool for further exploration of the role of SOX4 in tumorigenesis.Keywords: SOX4 protein, fusion protein, monoclonal antibody, tumorigenesisJ于鸣等: SOX4单克隆抗体的制备及其在肿瘤细胞表达分析中的应用 261SOX 是一类SRY (Sex determination region of Y chomosome)相关基因构成的控制发育的基因家族, 在不同进化地位物种中具有高度的同源性, 编码一组在结构上与SRY相关的转录因子。

该转录因子家族所有成员的共同特点是含有一个高度保守的HMG盒 (High mobility group box) DNA结合结构域, 称为 SOX (SRY-related HMG-box)SOX4 是 SOX 家族成员之一, 在许多进化过程中发挥重要的作用, 如胚胎期心脏发育、神经系统发育和胸腺发育等SOX4(-/-) 小鼠由于心内膜嵴发育不完全, 在胚胎期14天可因循环衰竭而死亡[1]此外, SOX4 还参与早期 B 细胞、胰腺以及骨骼[2-6]等系统的发育过程近年来, 越来越多的研究发现, SOX4 在许多肿瘤细胞中高表达, 包括肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌等, 提示 SOX4可能也参与肿瘤的生长调控过程, 与肿瘤的发生、发展以及预后相关[7-11]然而, SOX4在肿瘤发生中发挥的作用至今仍未完全阐明, 其调控的靶基因以及与其相互作用的蛋白仍有待进一步发现为探索 SOX4 在肿瘤发生发展中的分子机制, 本研究通过分子生物学技术, 构建了GST-SOX4融合基因, 在原核细胞中获得了融合蛋白的可溶性表达应用谷胱甘肽-Sepharose 4B, 纯化了 GST-SOX4 融合蛋白。

用纯化的融合蛋白免疫小鼠, 筛选并获得可特异性识别 SOX4 的单克隆抗体, 进一步利用该抗体检测了 SOX4 在不同肿瘤细胞系、正常小鼠的不同组织、人肺癌旁及肿瘤组织中的表达1 材料与方法1.1 质粒、菌株、细胞与动物含人源SOX4(130~344 aa)编码区基因的真核表达载体 pXJ40-Myc-SOX4(130~344 aa)由本实验室克隆并保存原核表达载体 pGEX-KG-GST、大肠杆菌DH5a、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0均由本实验室保存雌性4~6周龄SPF级BALB/c小鼠由军事医学科学院动物中心提供1.2 生化试剂限制性内切酶购自 NEB 公司, T4 DNA连接酶购自 Invitrogen 公司, PCR回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自 Promega公司, DNA分子量标准购自 TaKaRa公司, 蛋白质分子量标准购自 Fermentas 公司, 谷胱甘肽-Sepharose 4B-珠子购自Amersham Pharmacia Biotech公司完全弗式佐剂、不完全弗式佐剂、GSH(还原型谷胱甘肽)、HAT、HT均购自Sigma公司1.3 表达载体的构建及鉴定用BamH I 和Hind III同时双酶切质粒 pXJ40- Myc-SOX4(130~344 aa)及原核表达载体 pGEX-KG- GST, 经琼脂糖凝胶分离、纯化目的片段, 在 T4 DNA 连接酶的作用下连接。

用连接产物转化大肠杆菌 DH5a, 提取质粒DNA, 通过酶切鉴定重组阳性克隆 pGEX-KG-GST-SOX4(130~344 aa)1.4 GST-SOX4(130~344 aa)融合蛋白的诱导表达将pGEX-KG-GST-SOX4(130~344 aa) 表达载体转化菌接种于 5 mL LB培养基, 在37oC下用 1 mol/L IPTG 诱导分别收集 IPTG 诱导表达前后的菌液, 裂解后用 SDS-PAGE分离, 考马斯亮蓝染色, 分析融合蛋白的诱导表达同时用 IPTG诱导 pGEX-KG-GST 空载体转化的大肠杆菌 DH5a作对照1.5 GST-SOX4(130~344 aa)融合蛋白的纯化将pGEX-KG-GST-SOX4(130~344 aa)表达载体转化的DH5a 接种于400 mL LB培养基中, 用 0.1 mol/L IPTG在20oC下低温诱导表达收集菌液超声后, 用谷胱甘肽-Sepharose 4B进行重组蛋白的纯化纯化后的谷胱甘肽-Sepharose 4B-珠子经过 GSH 洗脱, 获得 GST-SOX4(130~344 aa) 融合蛋白。

将融合蛋白真空冻干, 采用Bredford 法进行蛋白定量1.6 SOX4单克隆抗体的制备将100 mg GST-SOX4(130~344 aa) 融合蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化, 皮下注射4~6 周龄 BALB/c雌性小鼠首次免疫4周后, 将100 mg GST-SOX4(130~344 aa) 融合蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化, 对 BALB/c小鼠进行第2次皮下注射4周后, 进行第3次皮下注射于第3次免疫后的第 15天, 经尾静脉采血, 用 ELISA 法测定血清抗体的效价于第3次免疫4周后, 实施加强免疫加强免疫 3 d后, 取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株 SP2/0 细胞按常规方法融合用间接 ELISA 法筛选, 有限稀释法克隆化, 并按常规方法制备鼠单抗1.7 SOX4单克隆抗体的鉴定采用间接 ELISA 法测定单克隆抗体的效价; 通过Western blotting鉴定抗体的特异性用pXJ40- Myc空载体和pXJ40-Myc-SOX4分别转染 293T细胞, 转染48 h后裂解细胞应用SDS-PAGE分离细胞裂解液, 转印至硝酸纤维素膜, Western blotting分析抗体对SOX4蛋白的识别。

一抗分别采用抗Myc单克隆抗体及SOX4 单克隆抗体, 二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG, ECL显色1.8 SOX4蛋白在不同肿瘤细胞系中的表达分析检测的细胞包括：肝癌细胞 HepG2、乳腺癌细胞ZR-75-1、MDA-231和MCF-7、肺癌细胞 H460、结肠癌细胞HCT116、骨肉瘤细胞U2OS、人胚肾细胞HEK293及293T细胞通过Western blotting分析, 检测SOX4蛋白在不同细胞系中的表达1.9 SOX4蛋白在不同小鼠组织和人肿瘤组织中的表达分析分别取4~6周龄BALB/c小鼠的生殖腺、胸腺、脑等组织, 制备组织匀浆, 通过Western blotting分析, 检测SOX4蛋白在小鼠不同组织中的表达同时采集3对人肺癌及癌旁组织样品, 通过Western blotting分析, 检测人癌旁及肿瘤组织中SOX4蛋白的表达2 结果2.1 pGEX-KG-GST-SOX4(130~344 aa)原核表达载体的构建及鉴定将构建的pGEX-KG-GST-SOX4(130~344 aa) 原核表达载体用BamH I和Hind III双酶切, 经琼脂糖凝胶电泳分析, 可见酶切反应产物中出现大小约为 640 bp的片段, 表明目的片段已成功地插入表达载体(图1)。

经核酸序列测定, 证实插入片段为SOX4编码序列, 且序列完全正确用该表达载体转化大肠杆菌DH5α,。