体外siRNA抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的表达其它医学论文.doc

体外siRNA抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的表达_其它医学论文 作者：杨明峰，刘安定，郑专，陈建军，董学君【摘要】 目的: 筛选能高效抑制乳腺癌细胞株MCF7和MDAMB453端粒逆转录酶（hTERT）基因表达的RNA干扰靶点，为乳腺癌的基因 治疗 提供依据. 方法: 构建针对hTERT基因的三种siRNA(siRNAhTERT1, siRNAhTERT2和siRNAhTERT3)，分别转导入乳腺癌细胞株MCF7和MDAMB453，同时以无同源性的siRNAhTERT4作阴性对照，含GFP基因的载体作阳性对照. 应用实时聚合酶链反应（realtime PCR）和Western Blot技术检测siRNA处理前后hTERT基因表达变化；MTT法检测细胞生长率；流式细胞术分析基因沉默对细胞凋亡的影响. 结果: 与阴性对照组相比，siRNAhTERT1，siRNAhTERT2和siRNAhTERT3三个实验组siRNA转染细胞后，hTERT的mRNA表达量下调至21%~40%，蛋白表达下降至50%，而三个实验组间差异无统计学意义（P>0.05）. 转染48 h 后，MCF7细胞抑制率分别为(57±4.3)%，（61±4.3）%，（65±6.0）%；MDAMB453细胞抑制率分别为（45±5.1）%，（45±4.1）%，（50±4.0）%. 流式细胞仪检测结果显示，细胞凋亡率有所增加，MCF7细胞为(18.90±0.11)%，(27.30±0.18)%，(27.00±0.16)%；MDAMB453细胞为(12.25±0.17)%，（17.80±0.19）%，（20.60±0.21）%. 结论： 经siRNAhTERT1，siRNAhTERT2，siRNAhTERT3处理均可明显抑制MCF7和MDAMB453乳腺癌细胞的增殖及hTERT基因的表达，能够明显促进细胞的凋亡. 【关键词】 乳腺肿瘤；端粒酶逆转录酶；RNA干扰0引言端粒逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是端粒酶组成的亚单位，与肿瘤的发生、 发展 密切相关［1-2］. 新近的研究［3-4］表明，应用小片段干扰RNA（siRNA）沉默或下调hTERT表达，可降低端粒酶的活性，缩短端粒，从而使肿瘤细胞的生长受到抑制［5-6］. 不同siRNA转染效率的不同以及靶向hTERT的不同，siRNA对端粒酶活性抑制的程度也有所不同［7］. 本研究拟通过设计多对靶向hTERT基因的siRNA，转导入不同的乳腺癌细胞株，筛选出具有特异性下调hTERT基因表达的siRNA，旨在为乳腺癌的基因治疗提供依据.1材料和方法 1.1材料乳腺癌MCF7和MDAMB453细胞株(上海细胞生物研究所)；LipofectamineTM2000转染试剂，总RNA提取试剂Trizol，realtime PCR试剂盒（大连TakaRa公司）；兔抗hTERT多克隆抗体，辣根酶标记羊抗兔IgG（美国Sigma公司）；CO2孵育箱（HEPA CLASS 100, 德国Thermo公司）；实时荧光定量(realtime) PCR仪（Light Cycle，美国Roche公司）；流式细胞仪（EPICS XL，美国Coulter Beckma公司）；蛋白电泳和电转仪（VE186， 中国 上海天能科技有限公司）.1.2方法1.2.1siRNA设计根据hTERT基因的DNA序列（GenBank accession NO.NM_198255.1）设计出互补的3对（siRNAhTERT1，siRNAhTERT2和siRNAhTERT3）siRNA序列［8］，siRNAhTERT4为无同源性的阴性对照序列. siRNA片段由广州锐博生物科技有限公司合成，其序列为：siRNAhTERT1正义链：5′GGAGCAGCUGCGGCCCUCCdTdT3′,反义链：5′dTdTCCUCGUCGACGCCGGGAGG3′；siRNAhTERT2正义链：5′AAGAGGGCCGAGCGUCUCAdTdT3′,反义链：5′dTdTUUCUCC CGGCUCGCAGAGU3′； siRNAhTERT3正义链：5′UGAUUUCUUGUUGGUGACAdTdT3′,反义链：5′dTdTACUAAAGAACAACCACUGU3′；siRNAhTERT4正义链：5′GGCCTAGCTGCGCGAGU3′,反义链：5′GGCCTCAGCTGCGCGACGA3′.1.2.2siRNA转染转染前1 d，换取新鲜培养液后调整密度为2×108个/L，待细胞生长至60%～80%融合时，将siRNA脂质体混合物（100 μg/5 L）转染至细胞中，在37℃，50 mL/L CO2无血清、无抗素培养液培养16～18 h，换新鲜100 mL/L胎牛血清培养基，继续培养2～5 d后检测各指标. 实验分为空白对照组（不含转染试剂和siRNA）；阴性对照组（siRNAhTERT4处理）；阳性对照组（含GFP基因的载体处理）和三个实验组（siRNAhTERT1，siRNAhTERT2和siRNAhTERT3处理）.1.2.3siRNAhTERT转染乳腺癌细胞株后hTERT表达变化的检测1.2.3.1实时聚合酶链反应（realtime PCR）分别收集各组转染后48 h的细胞，提取细胞总RNA，逆转录成cDNA. 取RT产物作为模板，进行realtime PCR，检测hTERT引物为：正义5′CCGTCTGCGTGAGGAGATC3′, 反义5′TCCGGTAGAAAAAGAGCCTGTT3′；hTERT Taqman探针：5′（FAM）GGCCAAGTTCCTGCACTGGCTGACT（TAMARA）3′；GAPDH引物：正义5′CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT3′，反义5′GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT3′；GAPDH Taqman探针：5′（FAM）AACAGCGACACCCACTCCTCCACC（Eclipse）3′. Realtime PCR反应体系为20 μL，包括：2×Premix EX TagTM缓冲液10 μL,10 μmol/L上下游引物各0.4 μL,探针0.8 μL, cDNA 2 μL,加双蒸水补足至20 μL. 反应条件：95℃ 10 s预变性后，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共40个循环，每个样本设三个平行反应. GAPDH作为内参对照校正上样量. 以2(ΔΔCT) 方法 计算 hTERT mRNA的相对表达量.1.2.3.2免疫印迹（Western Blot）检测分别收集转染48 h后的各组细胞，用预冷的PBS进行洗涤，加入蛋白裂解液进行裂解，提取总蛋白. 分别取50 μg蛋白，变性后经100 mL/L SDSPAGE分离，将凝胶置转移缓冲液中平衡15 min，再80 V 1.5 h湿转印蛋白到PVDF上， 100 mL/L FBS/TBST 4℃封闭过夜，加一抗，37℃震荡温育1 h, TBST漂洗3次，每次15 min，加HRP标记二抗，37℃震荡温育1 h, TBST漂洗3次，每次15 min. 取等量的ECL发光试剂A，B液混匀后孵育硝酸纤维素膜，压曝光，以βactin为内参.1.2.4MTT法检测取对数生长期细胞，经2.5 g/L胰蛋白酶消化，用含100 mL/L新生牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔3×103个细胞接种96孔培养板中，加入培养液200 μL，37℃，50 mL/L CO2培养箱培养. 次日进行瞬时转染，分别在转染后24,48,72,96 h进行检测. 检测时每孔中加入5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h，到达检测点时弃去培养液，再加入DMSO 200 μL，震荡10 min，于自动酶标仪492 nm波长处测定各孔吸光度（A）值. 按照公式计算细胞生长抑制率. 抑制率(%)=［(对照组A492 nm-实验组A492 nm) /对照组A492 nm］×100%.1.2.5细胞调亡的流式细胞术检测收集转染后48 h各组细胞，预冷PBS洗涤2次，用预冷的1×结合缓冲液重悬细胞，调整终密度为5×109个/L，将试管置于冰上，加5 μL的Annexin VFITC溶液和2.5 μL的碘化丙啶（propidium iodide, PI ）至100 μL的细胞悬液中，避光孵育10 min后，加入400 μL冰预冷的1×结合缓冲液，30 min内用流式细胞仪进行检测，分析各组细胞的凋亡情况.统计学处理：采用SPSS11.0统计分析软件，细胞增殖实验中各处理组与对照组进行配对t检验，各实验组间进行F检验. P<0.05为差异具有统计学意义.2结果 2.1siRNA转染后绿荧光蛋白的表达倒置显微镜明视野下，阴性对照组和阳性对照组细胞生长正常，形态无明显变化；倒置荧光显微镜暗视野下，阳性对照组的部分细胞胞内呈现绿色（图1）.A,C: 转染含GFP基因的载体后MCF7和MDAMB453细胞表达绿荧光蛋白; B,D: 明视野下MCF7和MDAMB453细胞的生长形态. 图1倒置荧光显微镜下MCF7和MDAMB453细胞的绿荧光蛋白表达×4002.2转染后细胞hTERT表达的变化以阴性对照组原始模板的相对浓度为标准，经 siRNAhTERT1，2和3转染后，hTERT mRNA的相对表达量，MCF7细胞分别为：35%，30%，31%；MDAMB453细胞分别为36%，33%，21%，siRNAhTERT1，2和3三个实验组间进行H检验，组间差异无统计学意义（P=0.368，P>0.05）. Western Blot检测结果显示，siRNAhTERT1，2和3三个实验组蛋白表达明显降低(P=0.00)，与阴性对照组相比较，三组间差异无统计学意义（P=0.223，P>0.05，图2）. 经siRNAhTERT1，2，3和4处理后，hTERT蛋白条带灰度MCF7细胞分别为35%，25%，24%，76%；MDAMB453细胞分别29%，23%，29%，70%.2.3转染后细胞增殖的变化48 h后siRNAhTERT1，2和3三个实验组和阴性对照组对MCF7细胞的抑制率分别为(57±4.3)%,（61±4.3）%,（65±6.0）%,（5.3±3.5）%；对MDAMB453细胞的抑制率分别为（45±5.1）%,（45±4.1）%,（50±4.0）%,(6.7±3.6)%. 配对t检验分析果显示，siRNAhTERT1，2和3三个实验组对MCF7细胞的生长抑制明显高于阴性对照组（P=0.023，0.016，0.028）；对MDAMB453细胞的生长抑制也明显高于阴性对照组（P=0.024，0.018，0.027），但三个实验组间的变化不明显（P=0.075, 0.085）.2.4基因沉默对细胞凋亡的影响siRNAhTERT1，2和3转染MCF7和MDAMB453细胞48 h后，流式双标记检测结果显示，与阴性对照组相比较，Annexin 单染和AnnexinV/PI双染阳性细胞明显增加（F=124，P=0.00，图3）. 其中，siRNAhTERT1，2和3三个实验组Annexin 单染的细胞凋亡率MCF7细胞为(18.90±0.11)%，(27.30±0.18)%，(27.00±0.16)%；MDAMB453细胞为(12.25±0.17)%,（17.80±0.19）%,（20.60±0.21）%.3讨论 目前用针对疾病相关基因的siRNA进行基因 治疗 已取得了一定的进展，已有几种RNA技术新药进入临床实验。