漆酶以及二氧化钛对木质素降解作用的研究.doc

漆酶以及二氧化钛对木质素降解作用的研究漆酶以及二氧化钛对木质素降解作用的研究摘要摘要木质素的降解受到生物催化与光催化的作用，那么它们二者到底是单独还是共同作用的 时候对木质素的降解更为高效呢，我们这里予以考察在这里漆酶作为一种生物催化降解 剂，而二氧化钛则是作为光催化降解剂它们被用于单步反应以及双步反应中为了方便 对比，我们考察了漆酶以及二氧化钛分别单独作用时对木质素的降解效果反应条件控制 为 50 ± 1 °C, pH 5.0，木质素（分子质量约 16000—175000）浓度为 1.0 g/L，双氧水在这 里被用作催化剂，来增强漆酶以及二氧化钛的降解效力结果显示双氧水在二氧化钛降解 木质素的过程中有着显著的作用：脱木质素效率达到了百分之百通过气相色谱法我们发 现双氧水与二氧化钛形成复合物的过程此外，实验过程中我们发现漆酶和二氧化钛不仅 能完成对木质素的降解，在降解过程中还产生了一些非常有用的副产品，例如琥珀酸和丙 二酸实验中发现这点也是十分值得作进一步研究讨论的1 介绍介绍木质素在自然界含量丰富，树木、植物以及农作物中都含有木质素，木质素与纤维素、 半纤维素一起构成了植物组织的主要成分。

木质素是由四种醇单体形成的一种复杂酚类聚 合物木质素难以被消化或破坏，而且因为木质素的棕色色泽，它在造纸工业长期被当做 一种废料，传统的白色纸张制造工艺中经常利用氯或氯化物的漂白作用来移除木质素，而 这样的工艺就会产生许多氯废料，例如氯酚一类物质，这些有毒物质都不能直接排放，必 须得经过处理解毒后才能避免对环境的污染保留的残渣由纤维素、半纤维素以及其他碳 水化合物组成虽然木质素经常被认为是一种没用的产品，但它却含有碳、氢、氧这些非 常有用的元素通过正确的处理过程，木质素可以作为生物燃料的原料然而，木质素的 高度异构化及其复杂的化学成分使得它需要通过降解来提高它的可用性 关于木质素的生物降解，之前已经有过这方面的研究，即从白腐真菌分离出的一种胞外 酶对木质素的降解作用这种酶——含铜复合物的漆酶，十分温和而且环保漆酶通过接 受来自铜的电子，传递给分子态的氧并使其还原为水，来催化底物的氧化漆酶用来生物 漂白牛皮纸浆（一种几乎是纯纤维素构成的纸浆）的作用已经被广泛研究过，这也是因为 其脱木质素的作用然而漆酶单独存在时的生物修复能力却受到限制，因为它只是专一作 用于木质素中的酚类化合物并排斥其他化合物。

据调查，1-羟基苯并并三唑（HBT） 、2,2- 二硝基二苯二硫（ABTS） 、紫脲酸（VLA） 、以及四甲基哌啶（TEMPO）这些试剂可以使 漆酶的作用对象扩大到木质素中的非酚醛单位然而这些试剂都很贵而且有些含有亚基， 比如 N–(OH)–，这些亚基会产生有毒化合物 半导体的晶格间隙比较大，有人认为，将光半导体材料引导的光催化过程应用于酶降解， 可以提高酶的降解效率例如，曾有研究，从黄孢原毛平革菌菌体提取的漆酶，在经过二 氧化钛参与的光催化预处理之后，对三硝基（TNT）的降解效率有显著的提高此外， Paralta-Zarnora 等人证实了，经过二氧化钛光催化预处理的漆酶的降解效率还受到辅助材料、 介质以及颜色的影响 二氧化钛是一种很有前景的光触媒，而且对木质素的降解有特别的潜力人们对于将二 氧化钛用作环境友好型材料的研究越来越感兴，因为它十分廉价，而且十分稳定，抗氧化 二氧化钛也能够抵抗大多数有机污染物的光氧化破坏作用，当它吸收了紫外线，就能够开 始降解那些有机物我们应该是首次将光催化氧化过程（二氧化钛和紫外线）与生物催化过程（漆酶）结合 起来降解大分子木质素的人，我们希望能够通过这个结合降解过程，提高木质素的降解效 率。

我们进行了多组重复实验（单一对照以及二者对比两个阶段）来对我们的假设进行研 究为了方便对比，我们考察了漆酶以及二氧化钛分别单独作用时对木质素的降解效果， 同时我们也对双氧水在降解过程中的作用进行了检测此外，还有待研究的是木质素降解 过程中所产生的一些中间产物，这些产物可能有在生物领域有潜在的，有待开发的应用 总的来说，我们做这个研究，是为了使漆酶或者二氧化钛，或者二者一起，作为环境友好 型产品，成为氯和氯化物之外的另一种取代品，它们的反应条件比较温和或者，也可以 将它们应用于生物工程的上游处理过程中2 2 实验过程实验过程2.1 试剂试剂漆酶（0.72 unit/mg） ，邻苯二酚（C6H4-1,2-(OH)2）,双氧水[30% (w/w) H2O2]，木质素 （碱性，分子质量 16000—175000） ，二氧化钛（99.9%） ，3，4-二甲氧基苯甲醛 （C9H10O3） ，硫酸(H2SO4)，醋酸钠(CH3COONa·3H2O)，醋酸(CH3COOH)，盐酸(HCl)以上 试剂是从西格玛奥德里奇大学（英国）购买的；N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺（BSTFA,99%） ， 二恶因以及吡啶是从费舍尔科学院（英国）购买的。

这些药品都是分析纯级别而且不需要 进一步提纯蒸馏水经过密理博公司（英国）生产的 Milli-Q 水纯化系统去离子过的2.2 其他实验仪器其他实验仪器注射器(BD Plastipak, 5 mL)以及注射过滤器(Millex-LCR, 0.45 μm)是从费舍尔科学院（英 国）购买的光化学反应是在一个配置有 6×4 W(飞利浦 TL-5W / 08、荷兰)紫外线管的紫 外线室中进行的紫外线管发出波长为 315–400 nm 的紫外光，这些光线具有很强的光化学 和荧光效果UV 箱以及控制器都被建在一个小的工作室中(生化工程学院，谢菲尔德大学). 在整个反应阶段，温度都受到严格的控制，控温装置包含一块集热板（self-adhesive heater mat, RS Components, U.K.） ，油浴器（将矿物油装在耐热玻璃皿）以及散热风扇(Bisonic, model 12p-230MB, Tubeaxal Fan, Bisonic Technology Corp., U.K.).紫外线的强度通过光和有 效辐射仪（QSL-2100, Biospherical Instruments, Inc., U.K.）来测定，并将其强度调整为 5.30 ± 0.10 μE cm–2 s–1。

实验中使用的 UV 箱的原理图见补充信息中的图 S12.3 木质素降解反应过程木质素降解反应过程通过实验（每组都至少有两个平行组）来比较漆酶以及二氧化钛对木质素的降解能力， 同时也测定了过氧化氢对于反应的催化效果实验详细过程如下：（1） 、紫外线照射下的 木质素降解（控制变量，每组照射条件相同） ， （2）当过氧化氢存在时的木质素降解（控制 变量） ， （3）漆酶单独作用降解木质素(酶催化降解)， （4）二氧化钛单独作用（化学催化降 解） ， （5）过氧化氢存在时漆酶的降解作用， （6）过氧化氢存在时二氧化钛的降解作用， （7）在第一步反应中加入漆酶和二氧化钛同时作用， （8）先在第一步反应中加二氧化钛， 再在第二步反应中加入漆酶，进行降解， （9）过氧化氢存在时，在第一步反应中同时加入 漆酶以及二氧化钛， （10）过氧化氢存在时，在第一步反应中加入二氧化钛，第二步反应再 加入漆酶进行多组实验探究紫外线、过氧化氢、温度以及 pH 对酶催化以及二氧化钛催化过程的 影响(这些数据在补充信息中图 S2—S18 中一一描绘)结果显示在没有过氧化氢存在时，紫外线对漆酶的降解作用影响不大不加入过氧化氢以及加入过氧化氢二者对于脱木质素 的效率有接近 2—3 以及 1—2%的区别。

将温度的测量范围定在 30—70℃，而 pH 的测量 范围为 3—11测量发现，50±时漆酶作用的最适温度与此同时，光反应在温度超过 40℃ 时表现出稍微的不同另外，pH 在 5—7 对于漆酶的降解效率影响不大（参考补充信息） 综上所述，整个反应过程都控制在温度 50± 1 °C 以及 pH5.0 的条件下进行，时间为 24 小 时，反应是在一个封闭的系统中进行的，反应时要搅拌，搅拌转速为 110rpm反应是在 25mL 锥形瓶中进行的，而反应体系的总体积为 10mL在酶降解（漆酶）反应中，反应体 系的总体积是 10mL,其中包含终浓度为 2.5 units/mL 的漆酶以及 1 g/L 的漆酶，其余为醋酸 缓冲液（浓度为 0.05Mm,pH 为 5.0） 整个反应过程在暗处进行，避免光反应的发生对于 光反应过程，反应体系中包含终浓度为 3 g/L 的二氧化钛以及 1 g/L 的木质素，缓冲液同样 为醋酸缓冲液（0.05Mm,pH5.0） 整个反应过程在紫外线（5.30 ± 0.10 μE cm–2 s–1）照射 下进行，反应在之前提到过的一个含有六个小 UV 盒(Philips TL-4W/08,荷兰)的大 UV 箱中 进行。

单步反应过程与光反应过程中的条件一样，用的一样的设备，环境条件等等，但是 在反应起始时向反应体系中加入了终浓度为 2.5 units/mL 漆酶对于双步反应，在 50 °C 条 件下经过 24h 的紫外线照射之后，关闭紫外灯，再加入终浓度为 2.5 units/mL 的漆酶然后 再在暗处反应 24h，温度控制在 50± 1 °C所有的实验都在向反应体系加入终浓度 5.55 g/L 的过氧化氢的条件下重复进行了一遍， 通常都是在反应最开始加入过氧化氢溶液，唯独在双步反应的过程中，是在第二步加入漆 酶的时候被一起加入的2.4 分析方法分析方法 色度测定采用 CPPA 标准方法（H.5P 的标准）,引自 Archibald 等人通过氢氧化钠将样 品的 pH 调整到 7.6吸光度是 Ultraspec 2100 pro 紫外可见分光光度计（英国）测定的，将 吸光度转换为色度，采用的公式为：CU = 500(As/Ap)，标准曲线的制作是采用 500 铜铂钴 标准溶液（此处浓度为 0.132） ，木质素的降解百分比是通过测定其在 280nm 的吸光度，用 的是 Ultraspec 2100 pro 紫外分光光度计，最终通过以下公式进行计算：降解率 = (降解钱 木质素含量–降解后木质素含量) × 100/降解钱木质素含量。

样品的测定采用的是 GC 超气 相色谱-质谱法样品需要经过过滤，采用 0.45μm 膜过滤器过滤除去二氧化钛粉末，经过 处理后的样品试用盐酸调整 pH 至 2，经过乙酸乙酯萃取，在经过蒸干器蒸干一夜3 3 结果与讨论结果与讨论3.1 色谱分析色谱分析 图一所显示的色谱表明双氧水能够提高漆酶以及二氧化钛的木质素降解效率，就算在双 步反应中也有相同的作用，然后在加了漆酶和二氧化钛的单步反应中，双氧水表现出抑制 作用实验显示当双氧水存在时，降解作用提高到 17% 在没有过氧化氢参与时的单步反应以及双步反应中，色度分别减少了 25%以及 30%.双 步反应的脱木质素效率比单步反应的脱木质素效率要高，因为铜离子的释放，如上所述 然而当双氧水存在时，单步反应和双步反应的脱木质素效率表现出明显不同，单步反应降 低了 20%而双步反应达到了 100%的降解 在单步反应中，二氧化钛，紫外线以及双氧水都在反应开始时被加入到反应体系中，氢 氧根离子在这种体系中都结合到铜离子上，使得水中的氧气变少了这个体系能够有效抑 制漆酶的降解活性，并使光反应几乎不能够发生，氢氧根离子对于漆酶活性的抑制作用有 很多文章中都有描述。

（26）与此同时，在双步反应中，木质素和二氧化钛首先在 UV 箱中反应，然后再加入漆酶，第一步中光反应降解木质素 55%，而第二步反应中（漆酶/水/暗 环境）将剩余木质素完全降解了3.2 木质素降解作用木质素降解作用 木质素含量的测定是通过紫外分光光度计测定其在 280nm 处的光吸收，图 3 展示了各 种实验条件下，存在（不存在）双氧水时木质素的降解效率这些结果反映出和色度测定 时一样的降解趋势。