反向化学遗传学方法筛选NF-kB实验设计.docx

1反向化学遗传学方法筛选 NF-kB 通路抑制剂实验设计摘要：目的：NF-κB 信号通路在微循环障碍，肿瘤的发展等病理过程中都有重要的作用，抑制 NF-κB 信号通路可能成为抑制这些病理过程的新方法本文目的是探索能够筛选 NF-κB 信号通路抑制剂的方法方法：通过化学遗传学方法，通过化合物对 TRAF2 和 TRAF5 靶蛋白的作用，筛选出能够同时抑制这两种靶蛋白的化合物，再将其作用于细胞，通过 RT-PCR 技术检测化合物导致的靶蛋白的表达量，进而筛选出有效的靶蛋白抑制剂，再将化合物作用于动物模型，筛选出能抑制 NF-κB 信号通路的化合物，用于抑制 NF-κB 信号通路介导的微循环障碍等病理过程关键词：NF-κB 信号通路; 化学遗传学; RT-PCR; NF-kB 通路抑制剂;主要内容1.NF-KB 的概述`````````````````````````````````````````````````21.1 NF-KB/Rel 蛋白家族及结构````````````````````````````````21.2 IκB 蛋白家族``````````````````````````````````````````21.3 NF-KB 的活化信号转导途径````````````````````````````````22. NF-κB 信号通路介导的病理过程```````````````````````````````32.1. NF-κB 信号通路激活对肿瘤发生发展的促进作用````````````32.2. NF-KB 介导的微管内皮细胞的损伤`````````````````````````32.3 NF-KB 活化影响凝溶的平动态衡，促微血栓形成 `````````````33. NF-KB 信号途径抑制剂````````````````````````````````````````34.实验方法24.1 化学遗传学`````````````````````````````````````````````44.2 靶蛋白的选择```````````````````````````````````````````54.3 实验流程图```````````````````````````````````````````` 75.讨论````````````````````````````````````````````````````````86.参考文献````````````````````````````````````````````````````8核因子－KB（nuclear factor-kappa B,NF-KB)蛋白家族是一种多效性的转录因子，可以与多种基启动子部位的 KB 位点发生特异性的结合从而促进其转录表达。

其受氧化应激、细菌脂多糖，细胞因子等多种刺激而活化后，能调控前炎症性细胞因子、细胞表面受体、转录因子、粘附分子等的生成而这些刺激因素及其调控的因子与微循环障碍的发生、发展均有着密切的关系通过反向遗传学方法筛选 NF-KB 信号途径中的 TAK1 的抑制剂，从而阻断 NF-KB 信号途径，抑制 NF-KB 信号途径的激活，达到治疗 NF-KB 信号途径诱导的微循环障碍，抑制肿瘤的发展的目的1.NF-KB 的概述1.1NF-KB/Rel 蛋白家族及结构1986 年，Sen 等首次从鼠 B 淋巴细胞核提取物中，发现一种能与免疫球蛋白 K 轻链基因增强子 KB 序列(GGGACTTTCC)特异结合，调节其基因表达的核蛋白因子，称之为 NF-KB随后大量的研究又陆续发现了 NF-KB家族的其它成员，其构成亚基分别是 NF-KB1 (P50)、NF-KB2(P52)、P65（RelA） 、c-Rel（Rel)、RelB 等，因这些亚基的 N-末端均崐有约 300 个氨基酸残基的 Rel 同源区（rel homology domain ,RHD)，故统称为 NF-KB/Rel 蛋白家族其 RHD 内含 DNA 结合区，二聚体化区和核定位序列，分别具有与 DNA KB 序列结合、与同源或异源亚基二聚体化以及与 NF-KB 抑制蛋白（IKB）家族成员相互作用并携带核定位信号（NLS） ，参与活化的 NF-KB 由细胞质向细胞核的迅速移动等功能。

31.2 IκB 蛋白家族IKB 蛋白家族成员有 IKBα(MAD-3,pp40)、IKBβ、IKBγ/p105、IKBδ/p100、IKBε、Bcl-3 以及果蝇属的 Cactus 等其家族结构特点是均有多个约 33个氨基酸的重复序列，称为崐 SWI6/锚蛋白重复序列，主要参与与 Rel 蛋白的 RHD 相互作用IKB蛋白主要有以下三个部分构成：1.与蛋白降解有关的 N-末端区；2.能与 NF-KB相互作用的内部区（区内含有锚蛋白重复序列） ；3.称为 PEST 的 C－端区，主要参与“囚禁”NF-KB在细胞浆中IκB 蛋白家族作用：在细胞质中与 NF-κB 二聚体结合，并对信号应答具有重要作用1.3 NF-KB 的活化信号转导途径非活化状态的 NF-KB 以与 IKB 聚合的三聚体形式或与前体蛋白聚合的二聚体的形式存在于细胞浆中，在多种因素的刺激作用下，通过多种信号转导途径使 IKB 磷酸化，再在蛋白水解酶作用下发生降解，从而使 NF-KB 得以活化而转核发挥其调控作用最基本的 NF-κB 信号通路，包括受体和受体近端信号衔接蛋白， IκB 激酶复合物， IκB 蛋白和 NF-κB 二聚体。

当细胞受到各种胞内外刺激后，IκB 激酶被激活，从而导致 IκB 蛋白磷酸化，泛素化，然后 IκB蛋白被降解， NF-κB 二聚体得到释放然后 NF-κB 二聚体通过各种翻译后的修饰作用而被进一步激活，并转移到细胞核中在细胞核里，它与目的基因结合，以促进目的基因的转录NF-κB 有 经典信号通路和非经典信号通路，二者主要区别在于：在 NF-κB 的 经典信号通路中， IκB 蛋白的降解使 NF-κB 二聚体得到释放而在NF-κB 非经典信号通路中，则是通过 P100 到 P52 的加工处理，使信号通路激活2. NF-κB 信号通路介导的病理过程2.1. NF-κB 信号通路激活对肿瘤发生发展的促进作用NF-κB 所致的 GADD45α 和 γ（生长抑制 DNA 损伤基因）联合表达下调是很4多肿瘤细胞逃逸凋亡机制的关键步骤NF-κB 还可上调 CyclinD1（CCNDI） 等基因的表达, 促进细胞生长此外，NF-κB 激活对肿瘤的转移具有明显的促进作用2..2. NF-KB 介导的微管内皮细胞的损伤2.2.1.炎症性浸润引发的损伤 已知 ICAM-1 基因启动子上有１个基本的 NF-KB 位点，VCAM-1 基因有 2 个NF-KB 位点，E-sel 基因有 3 个 NF-KB 位点。

在 TNF、IL-1、LPS及活性氧作用下，能在 30min 内使 NF-KB 活化升高，并且持续很长时间，然后单独或与其它因子协同作用下，使 ICAM-1、VCAM-1、E-sel 在 2-4 小时内表达增加，6-12 小时内达到峰值，而且其表达升高与刺激物质呈时间、剂量依赖的方式不同途径抑制 NF-KB的活化或清除刺激来源后，均能相应地抑制这种活化和表达ICAM-1、VCAM-1、E-sel 能与白细胞表面的配体相应地结合，介导白细胞的贴壁粘附，致白细胞聚集、浸润，从而导致局部炎症的发生，微血管内皮细胞损伤，表现为微血管通透性增加、组织水肿等，微循环障碍发生2.2.2 NF-KB 活化后促内皮细胞的凋亡，致微血管损伤NF-KB 的活化能诱导内皮细胞的凋亡，主要有以下几种方面的证据：⑴在许多促调亡基因：C-myc、TNF 及 IL-1 转化酶（IL-1 converting enzyme,ICE）启动子上都发现了 KB 位点⑵TNF-α 诱导凋亡中出现了 NF-KB的伴随活化⑶胸腺细胞能活化 NF-KB 而诱导细胞凋亡⑷通过清除 NF-KB的诱导物活性氧（reactive oxygen species,ROS）能抑制凋亡的发生。

也有研究表明在恶性肿瘤，变态反应和自身免疫疾病中，NF-KB 通过上调凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis,IAP）而抑制瘤细胞等的凋亡，从而加重了疾病的发生，这可能与 Rel 家族不同成分及不同的刺激、信号途径有关2.3 NF-KB 活化影响凝溶的平动态衡，促微血栓形成52.3.1 NF-KB 活化促进 vWF(von Willebrand Factor)的表达vWF是Ⅷ因子的相关因子，它与Ⅷ因子结合，能有效防止Ⅷ在血浆中迅速降解VWF 与Ⅷ结合，组成 FⅧ/VWF，一端与血小板糖蛋白 Ib 结合，另一端与内皮细胞下的胶原纤维连接，介导血小板粘附血管内皮，促进微血栓形成Keightley 报道 p50 能与 VWF启动子结合，从而影响血液中 vWF 水平镰刀型贫血病时高水平的 vWF 介导镰刀型 RBC 的聚集及与内皮细胞的粘附，并且促进血小板内皮细胞粘分子（platelet-endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1）的磷酸化，抑制 NF-KB 则明显改善这些指标2.3.2 NF-KB 调控内皮细胞合成组织因子（Tissue factor）这是一种亲脂性蛋白能作为受体与Ⅶ因子和Ⅶa 结合而形成复合物，使 IX和 X 裂解，从而既激活外凝系统又激活内凝系统。

IL-1、LPS、TNF 均能通过刺激 NF-KB 促进其的合成，在 2h 达到峰值，且存在时间，剂量依赖性，已在内毒素血症 DIC 的发生发展中得到证实2.3.3 NF-KB 对纤溶的影响 纤溶与抗纤溶在正常情况下维持动态平衡但纤溶酶原激活抑制物－2（Plasminogen activator inhibitor type-2,PAI-2）启动子上有两个 KB位点TNF-α 能刺激 NF-KB 促 PAI-2 的表达Dechend 也报道动脉粥样硬化时内皮细胞产生的 PAI、组织因子等促凝血蛋白质的升高伴随着 NF-KB 的活化而 p65的持续活化则能促进 uPA（urokinase-type PA）的表达，因为 uPA启动子上也发现了一个 KB 位点NF－KB 的活化能紊乱微血管的纤溶系统3. NF-KB 信号途径抑制剂因此，NF-KB 在微循环障碍的发生发展中有重要的作用，微循环障碍广泛发生于临床各种疾病、创伤及某些生理应激情况下,其发生不仅是局部或全身组织器官的损伤的标志,而且持续的微循环障碍更加重了疾病的发生、发展及预后因此通过抑制 NF-KB 的激活,从而阻断 NF-KB 调控的炎症反应，缓解微循环障碍,减轻机体组织的损伤。

6但是临床中尚未出现抑制 NF-KB 信号途径的有效药物，本文主要通过化学遗传学方法，以 TRAF2 和 TRAF5 为靶蛋白，筛选能够同时抑制这两种靶蛋白的化合物，进而抑制 NF-KB 信号途径，达到治疗目的4.实验方法 4.1.化学遗传学化学遗传学(chemical genetics)现在越来越引起学者们的关注,它利用细胞渗透性的生物活性小分子作为分子探针对细胞内过程进行精确的干扰,利用这种方法可以研究蛋白在培养的细胞中或整个有机体中的功能,进而对一些复杂的细胞内过程进行阐释,并可探寻和证实药物的靶标,产生新的治疗法化学遗传学与传统遗传学有着紧密的联系正如传统遗传学方法中的一个重要突变体的分离筛选会鉴别出导致突变的基因,小分子作用方式的阐明会发现有重大意义的分子内靶标这两种方法都以获得遗传突变或药剂干扰引起的表型开始,然后鉴别出突变基因的产物或天然产物靶蛋白,进一步研究这些蛋白干扰。