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第四章第四章 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化l将酶从细胞或发酵液中取将酶从细胞或发酵液中取出，再与杂质分开，获得出，再与杂质分开，获得所需的酶产品所需的酶产品l酶的分离纯化工作酶的分离纯化工作, ,是酶学是酶学研究的基础研究的基础. .l酶的纯化过程就目前而言酶的纯化过程就目前而言, ,还是门实验科学还是门实验科学. .酶的分离纯化最新酶的纯化过程与一般蛋白纯化酶的纯化过程与一般蛋白纯化过程相比有本身独有的特点过程相比有本身独有的特点: :一是特定的一种酶在细胞中含一是特定的一种酶在细胞中含量很少量很少; ;二是酶可通过测定活二是酶可通过测定活力的方法加以跟踪力的方法加以跟踪. .1 1、建立一个可靠和快速的测活方法；、建立一个可靠和快速的测活方法；2 2、酶原料的选择；、酶原料的选择；3 3、酶的提取；、酶的提取；4 4、酶的提纯；、酶的提纯；5 5、酶的纯度检验酶的纯度检验酶分离纯化的一般原则酶分离纯化的一般原则: :酶的分离纯化最新第一节第一节 细胞破碎细胞破碎（（link)link)第二节第二节 酶的提取酶的提取 ( (link)link)第三节第三节 沉淀分离沉淀分离( (link) link) 第四节第四节 离心分离离心分离第五节第五节 过滤与膜分离过滤与膜分离 第六节第六节 层析分离层析分离第七节第七节 电泳分离电泳分离 第八节萃取分离第八节萃取分离 第九节第九节 酶的结晶酶的结晶 第十节第十节 浓缩与干燥浓缩与干燥本章主要内容本章主要内容: :go酶的分离纯化最新第一节第一节 细胞破碎细胞破碎v一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。

用超声波处理破碎v植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的v细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研非常坚韧破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）酶的分离纯化最新l细胞的破碎方法：细胞的破碎方法：l一、机械破碎法一、机械破碎法 l二、物理破碎法二、物理破碎法 l三、化学破碎法三、化学破碎法 l四、酶学破碎法四、酶学破碎法 back酶的分离纯化最新l原理：机械运动所产生的剪力作用于细胞原理：机械运动所产生的剪力作用于细胞l1 1 机械捣碎法：捣碎机，机械捣碎法：捣碎机，1000010000rpmrpm，，实验、生产规模实验、生产规模 均可均可l2 2 研磨法：研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械，研磨法：研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械， 效率较低效率较低l3 3 匀浆法：匀浆器，用于颗粒细小的组织细胞匀浆法：匀浆器，用于颗粒细小的组织细胞 破碎程度高。

对酶破碎少，难于工业化破碎程度高对酶破碎少，难于工业化Back一、机械破碎法一、机械破碎法酶的分离纯化最新包括包括: :1 1、温度差破碎法、温度差破碎法; ;2 2、压力差破碎法、压力差破碎法; ;3 3、超声波破碎法、超声波破碎法; ;二、物理破碎法二、物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎素的作用使组织细胞破碎酶的分离纯化最新1 1、温度差破碎法、温度差破碎法冷冻冷冻 高温，用于脆弱易破菌，难以工业化高温，用于脆弱易破菌，难以工业化; ;于冷藏库或干冰反复于零下于冷藏库或干冰反复于零下1515～～20℃20℃使之冻固，然后缓慢地使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏由融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性冻结变性 或或: :将材料投入沸水中，于将材料投入沸水中，于90℃90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。

中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏 酶的分离纯化最新2 2 2 2、、、、压压力差破碎法力差破碎法力差破碎法力差破碎法高压冲击法高压冲击法用活塞或冲击锤加高压冲击菌体细胞和冰晶石英用活塞或冲击锤加高压冲击菌体细胞和冰晶石英沙等混合物沙等混合物突然降压法突然降压法加压至加压至3030MPMP以上，打开出口阀突然降为常压以上，打开出口阀突然降为常压爆破性减压法爆破性减压法用氮气或二氧化碳充压至几十至几百大气压用氮气或二氧化碳充压至几十至几百大气压渗透压差法渗透压差法利用渗透压的变化而使细胞破碎，常用于从海洋利用渗透压的变化而使细胞破碎，常用于从海洋微生物中提取某些酶微生物中提取某些酶酶的分离纯化最新频率频率 10~20 10~20KHzKHz，，功率功率100~150100~150W W，，温度温度0~100~10o oC C，， pH4~7 pH4~7，，时间时间3~103~10minmin，，间隔多间隔多次次; ;对数生长期细胞，细胞浓度和溶液粘对数生长期细胞，细胞浓度和溶液粘度不宜太高暴露于度不宜太高暴露于9 9～～10kHz10kHz声波或声波或1010～～500kHz500kHz超声波所产生的机械振动，只要有超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便设备该法方便. .且效果也好，但一次处理且效果也好，但一次处理量较小量较小; ;应用超声波处理时应注意避免溶应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在液中气泡的存在; ;处理一些超声波敏感的处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。

蛋白质酶时宜慎重3 3、超声波破碎法、超声波破碎法在超声波的作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎破坏程在超声波的作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎破坏程度与输出功率、破碎时间密切相关，与频率关系不大度与输出功率、破碎时间密切相关，与频率关系不大操作条件操作条件Back酶的分离纯化最新三、化学破碎法三、化学破碎法应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏构改变或破坏有机溶剂（如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）可使细胞膜的磷脂有机溶剂（如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外或胞内酶等释出胞外￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿1 1、有机溶液、有机溶液粉碎后的新鲜材料在粉碎后的新鲜材料在0℃0℃以下加入以下加入5 5～～1010倍量的丙酮，迅速倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。

蛋搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末用少量乙白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性操作操作酶的分离纯化最新表面活性剂表面活性剂( (溶于液体后，具有使表面张力显著降低作用的物质溶于液体后，具有使表面张力显著降低作用的物质)和和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性破坏，增加膜的透过性离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，不用之离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，不用之常用的非离子型表面活性剂为：常用的非离子型表面活性剂为： Triton( Triton(辛基酚聚氧乙烯醚辛基酚聚氧乙烯醚,聚乙二醇辛基苯基醚聚乙二醇辛基苯基醚￿); Tween( Tween(聚氧乙烯山梨醇酐聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸单棕榈酸单棕榈酸单棕榈酸酯酯,吐温吐温,聚氧乙烯山梨醇酐聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸三硬脂酸酯酯 ) )用凝胶层析等方法除去表面活性剂，以便酶的进一用凝胶层析等方法除去表面活性剂，以便酶的进一步纯化。

对膜结合酶的提取特别有效对膜结合酶的提取特别有效2 2、表面活性剂、表面活性剂Back酶的分离纯化最新四、酶学破碎法四、酶学破碎法在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用，使细胞破碎的作用，使细胞破碎简单原理简单原理: :溶菌酶处理时，它能水解构成枯草溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类能溶解菌的酶分布很广菌等菌体膜的多糖类能溶解菌的酶分布很广尤其卵白中含量高，而多易结晶化尤其卵白中含量高，而多易结晶化1 1、外加酶、外加酶酶的分离纯化最新1g1g菌体加菌体加1 1～～10mg10mg溶菌酶，溶菌酶， pH6.2pH6.2～～7.01h7.01h内完全溶菌于生理内完全溶菌于生理食盐水或食盐水或0.2mol0.2mol蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出蜗牛酶及纤维素酶蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用也常被选为破坏细菌及植物细胞用革兰氏阳性菌：细胞结构和形状依赖于壁上的肽多糖，革兰氏阳性菌：细胞结构和形状依赖于壁上的肽多糖，溶菌酶溶菌酶能专一性作用于肽多糖的能专一性作用于肽多糖的β-1β-1，，4-4-糖苷键。

糖苷键革兰氏阴性菌：除了革兰氏阴性菌：除了溶菌酶外，另加溶菌酶外，另加EDTAEDTA才有效酵母：其细胞壁的主要成分是酵母：其细胞壁的主要成分是β-1β-1，，3-3-葡聚糖，需加葡聚糖，需加ββ- -葡聚葡聚糖酶糖酶；；霉菌：其细胞壁含有几丁质，可用霉菌：其细胞壁含有几丁质，可用几丁质酶几丁质酶；；植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶酶的分离纯化最新将待破碎的鲜材料在一定将待破碎的鲜材料在一定pHpH和适当的温度下，利用自身的蛋白和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等应防止细菌污自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等应防止细菌污染于温室染于温室30℃30℃左右较早溶化左右较早溶化自体融解过程中自体融解过程中PHPH显著变化，随时要调节显著变化，随时要调节pHpH自溶温度选在自溶温度选在0 0～～4℃4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制备，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用活性蛋白质时较少用适宜的自溶条件：温度、适宜的自溶条件：温度、pHpH值、离子强度等值、离子强度等加入噬菌体感染细胞加入噬菌体感染细胞电离辐谢电离辐谢2 2、自溶法、自溶法Back酶的分离纯化最新第二节第二节 酶的提取酶的提取l是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。

也称酶的抽提酶充分溶解到溶剂中的过程也称酶的抽提l目的目的:￿让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏l大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中因此蛋白质的提取一般以水为主因此蛋白质的提取一般以水为主l稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂是提取蛋白质的最常用溶剂 酶的分离纯化最新盐溶现象盐溶现象: :在一定浓度的盐存在下在一定浓度的盐存在下, ,酶的溶解度增加酶的溶解度增加. .盐析现象盐析现象: :当盐的浓度太高当盐的浓度太高, ,蛋白的浓度反而下降蛋白的浓度反而下降, ,从溶液中析出从溶液中析出. .一一般采用稀盐溶液，般采用稀盐溶液，0.02~0.050.02~0.05mol/Lmol/L 等渗盐溶液尤以等渗盐溶液尤以0.020.02～～0.05mol/L0.05mol/L磷酸盐缓冲液和碳酸盐磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用缓冲液常用。

0.15mol/L0.15mol/L氯化钠溶液应用也较多如氯化钠溶液应用也较多如6-6-磷磷酸葡萄糖脱氢酶用酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L0.1mol/L碳酸氢钠液提取等碳酸氢钠液提取等一、酶提取的主要方法一、酶提取的主要方法1 1、盐溶液提取、盐溶液提取酶的分离纯化最新蛋白质提取液的蛋白质提取液的pHpH值首先应保证在蛋白质稳定的范值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧围内，即选择在偏离等电点两侧如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取 2、、酸溶液提取、碱溶液提取酸溶液提取、碱溶液提取原则：原则：酶的分离纯化最新如细胞色素如细胞色素C C属碱性蛋白质，常用稀酸提取；属碱性蛋白质，常用稀酸提取；肌肉甘油醛肌肉甘油醛-3--3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱提取；提取；某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键形式某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键形式存在，选择存在，选择pH3pH3～～6 6范围对于分离提取是有利的。

范围对于分离提取是有利的酶的分离纯化最新与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶需用有机与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶需用有机溶剂提取溶剂提取有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的一些和脂有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的一些和脂结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取例例:从一些粒线体（从一些粒线体（Mitochondria)Mitochondria)及微粒体（及微粒体（Microsome)Microsome)等含多量等含多量脂质物质中提取蛋白质时，采用脂质物质中提取蛋白质时，采用MortonMorton的丁醇法效果较好的丁醇法效果较好因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解水也能溶解10%10%，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。

蛋白质在水中溶解能力大大增加3、有机溶剂提取、有机溶剂提取酶的分离纯化最新二、影响酶提取的主要因素二、影响酶提取的主要因素1 1、温度、温度为了防止酶变性失活，温度不宜高；为了防止酶变性失活，温度不宜高；多数酶的提取温度在多数酶的提取温度在5℃5℃以下；以下；耐温较高的酶可适当提高温度，以提高酶溶解度和扩散速率耐温较高的酶可适当提高温度，以提高酶溶解度和扩散速率少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化如胃蛋白酶等及许多多肽激素类，选择如胃蛋白酶等及许多多肽激素类，选择3737～～50℃50℃条件下提取，条件下提取，效果比低温提取更好效果比低温提取更好酶的分离纯化最新2 2、、pHpH值值为了防止酶的变性，为了防止酶的变性，pHpH不宜过高或过低；溶液的不宜过高或过低；溶液的pHpH值应远离酶的等电点，以增加酶的溶解度值应远离酶的等电点，以增加酶的溶解度3 3、提取液的体积、提取液的体积提取液的用量增加，可提高提取率；提取液的用量增加，可提高提取率；过量，酶浓度降低，不利进一步纯化。

过量，酶浓度降低，不利进一步纯化酶的分离纯化最新l从细胞中提取得到的生物大分子往往是不从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分粗分级分离和细分级分离级分离两步进行两步进行酶的分离纯化最新蛋白蛋白质（（酶）的分离）的分离纯化化l蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的￿￿￿￿￿￿性质性质￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿方法方法l分子大小分子大小￿￿￿￿￿￿￿￿￿透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤l￿溶解度溶解度￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀l电荷电荷￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析l吸附性质吸附性质￿￿￿￿￿￿￿￿￿吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析）吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析）l对配体分子对配体分子￿￿￿￿￿￿亲和层析亲和层析￿￿￿￿的生物亲和力的生物亲和力酶的分离纯化最新主要是利用主要是利用盐析盐析法、等电点法、等电点沉淀沉淀、有机溶剂、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低但分辨率低.1 1、粗分级分离、粗分级分离酶的分离纯化最新2 2、、细分分级分离分离l一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。

进一步提纯，通常使用高分质大部分被除去进一步提纯，通常使用高分辨率的辨率的柱层析及电泳柱层析及电泳方法l常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析析、疏水吸附层析、亲和层析l常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳聚焦电泳l另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用Back酶的分离纯化最新第三节第三节 沉淀分离沉淀分离改变某些条件，使溶液中某种溶质溶解度降低，改变某些条件，使溶液中某种溶质溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出，达到与其它溶质分离从而从溶液中沉淀析出，达到与其它溶质分离是酶分离纯化常用的方法之一是酶分离纯化常用的方法之一其本质是降低溶液的溶解度其本质是降低溶液的溶解度方法有盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、方法有盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合沉淀等复合沉淀等,表表4-3.酶的分离纯化最新在某一浓度的盐溶液中，不同的蛋白质和酶因溶解度各不相同在某一浓度的盐溶液中，不同的蛋白质和酶因溶解度各不相同而分离。

而分离盐为什么会改变蛋白酶的溶解度？盐为什么会改变蛋白酶的溶解度？盐在溶液中离解为正负离子，反离子作用改变蛋白酶分子表面盐在溶液中离解为正负离子，反离子作用改变蛋白酶分子表面的电荷；同时离子存在改变水活度使分子表面水化膜改变的电荷；同时离子存在改变水活度使分子表面水化膜改变一、盐析沉淀法一、盐析沉淀法『『盐溶盐溶』』是加盐使蛋白质融入水中，是加盐使蛋白质融入水中，『『盐析盐析』』是加盐使蛋白质是加盐使蛋白质沉淀出來两者所加的盐类不同，其作用机制也毫无关系沉淀出來两者所加的盐类不同，其作用机制也毫无关系 酶的分离纯化最新在低盐浓度下在低盐浓度下, ,蛋白质和酶溶解度随盐浓度升高而增加蛋白质和酶溶解度随盐浓度升高而增加盐溶盐溶酶的分离纯化最新盐析盐析盐浓度升高到一定浓度后盐浓度升高到一定浓度后, ,蛋白酶的溶解度又随蛋白酶的溶解度又随着盐浓度升高而减少着盐浓度升高而减少, ,蛋白酶沉淀析出蛋白酶沉淀析出. .一旦蛋白质溶液加入硫酸銨，后者吸引了大量水分子，使水笼一旦蛋白质溶液加入硫酸銨，后者吸引了大量水分子，使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸引，因而沉淀下來。

因此，分子表面上若有越多的非极性区域，引，因而沉淀下來因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就越容易用硫酸銨沉淀下來就越容易用硫酸銨沉淀下來酶的分离纯化最新式中：式中：S S、、SoSo：：蛋白质或酶在离子强度为蛋白质或酶在离子强度为I I和和0 0时的溶解度（时的溶解度（g/Lg/L））KsKs：：盐析常数，取决于盐的性质和酶的结构盐析常数，取决于盐的性质和酶的结构I I：：离子强度离子强度, ,与离子浓度与离子浓度m mi i和离子价数和离子价数Z Zi i有关 I=1/2∑mI=1/2∑mi iZ Zi i2 2酶在溶液中的溶解度与溶液中的离子强度的关系式：酶在溶液中的溶解度与溶液中的离子强度的关系式：蛋白质和酶在溶液中的溶解度与蛋白质和酶在溶液中的溶解度与溶液中的离子强度有密切的关系溶液中的离子强度有密切的关系酶的分离纯化最新β=LogSo β=LogSo ：：取决于酶的性质，也与温度和取决于酶的性质，也与温度和pHpH有关KsKs：主要取决于盐性质与离子价数成正比，与离子半径与溶：主要取决于盐性质与离子价数成正比，与离子半径与溶液介电常数成反比液介电常数成反比ββ与与KsKs确定后，蛋白酶溶解度决定于确定后，蛋白酶溶解度决定于I IKsKs分段盐析分段盐析: : T T、、pHpH一定下改变离子强度一定下改变离子强度ββ分段盐析分段盐析: : 一定盐和离子强度下，改变一定盐和离子强度下，改变T T、、pHpH常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。

磷酸钠等盐析所需添加饱和硫酸铵体积式：盐析所需添加饱和硫酸铵体积式：温度和温度和pHpH一定时，一定时，SoSo为常数，为常数，酶的分离纯化最新l 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀如：不同的蛋白质分别沉淀如：血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白( (NHNH4 4) )2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出分段盐析分段盐析酶的分离纯化最新l常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失会引起蛋白质活性丧失l盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性l蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步精提纯。

脱盐常用能进一步精提纯脱盐常用透析法透析法 透析透析是将含有小分子杂质是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜的蛋白质溶液装在半透膜（玻璃纸、火绵纸等）制的（玻璃纸、火绵纸等）制的透析袋里放在蒸馏水中进行，透析袋里放在蒸馏水中进行，可不断更换蒸馏水，直至杂可不断更换蒸馏水，直至杂质被除去质被除去透析袋透析袋蛋白质溶液蛋白质溶液蒸馏水蒸馏水酶的分离纯化最新利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质（如酶、蛋白质、氨基酸等）具有不的两性电解质（如酶、蛋白质、氨基酸等）具有不同的等电点这一特性进行分离纯化的方法同的等电点这一特性进行分离纯化的方法等电点时，分子表面的水膜仍然存在，使酶和蛋白等电点时，分子表面的水膜仍然存在，使酶和蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全故常用于粗酶质仍有一定的溶解度而沉淀不完全故常用于粗酶液中除杂和与其它方法联系使用液中除杂和与其它方法联系使用二、等电点沉淀法二、等电点沉淀法酶的分离纯化最新图图例例酶的分离纯化最新￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿介介电常数常数￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿溶溶质分子之分子之间的引力的引力￿￿￿￿￿￿￿￿溶解溶解度度有机溶有机溶剂￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿溶溶质分子周分子周围的水膜破坏的水膜破坏￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿酶和蛋白和蛋白质的的氢键破坏破坏￿￿￿￿空空间结构构变化化￿￿￿￿￿形成疏水形成疏水层三、有机溶剂的沉淀法三、有机溶剂的沉淀法利用酶等物质在有机溶液中的溶解度不同而使之分离的方法。

利用酶等物质在有机溶液中的溶解度不同而使之分离的方法介电常数介电常数permittivity permittivity 亦称相对电容率是指在同一容器亦称相对电容率是指在同一容器中用某一物质为电介质和真空时的电容的比值介电常数通常中用某一物质为电介质和真空时的电容的比值介电常数通常随温度和介质中传播的电磁波的频率而变电介质的介电常数随温度和介质中传播的电磁波的频率而变电介质的介电常数越大，极化能力越强；介电常数越小，绝缘性能越好用越大，极化能力越强；介电常数越小，绝缘性能越好用εrεr表示表示 酶的分离纯化最新（（1 1）所析出酶沉淀比盐析法析出的易于）所析出酶沉淀比盐析法析出的易于 离心分离或过滤；离心分离或过滤；（（2 2）不含无机盐，适于食品工业用酶制）不含无机盐，适于食品工业用酶制 剂的制备；剂的制备；（（3 3）易于除去或回收易于除去或回收￿￿￿￿优点：优点：缺点：缺点：易于引起酶的变性失活，需低温操作和沉淀易于引起酶的变性失活，需低温操作和沉淀析出后尽快分离析出后尽快分离酶的分离纯化最新酶酶+ +酶沉淀剂酶沉淀剂 复合物沉淀复合物沉淀 分离分离 从复合物中析出酶从复合物中析出酶￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿四、复合沉淀法四、复合沉淀法常用的酶沉淀剂：常用的酶沉淀剂： 单宁（加入量为酶液的单宁（加入量为酶液的0.1~1%0.1~1%。

聚丙烯酸（聚丙烯酸（30~40%30~40%）等高分子聚合物）等高分子聚合物酶的分离纯化最新五、选择性变性沉淀五、选择性变性沉淀l使杂蛋白变性沉淀，而酶不受影响；使杂蛋白变性沉淀，而酶不受影响；l热稳定性好的，可进行热处理；热稳定性好的，可进行热处理；l改变改变pHpH或加入某些金属离子使杂蛋白除去；或加入某些金属离子使杂蛋白除去；back酶的分离纯化最新第四节第四节 离心分离离心分离离心：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大离心：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、密度的物质分离的技术；小、密度的物质分离的技术；要根据欲分离物质及杂质的大小、密度和特性的不要根据欲分离物质及杂质的大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件酶的分离纯化最新1 1、常速离心机、常速离心机 最大转速最大转速80008000rpm(r/min),rpm(r/min),相对离心力相对离心力(RCF)10(RCF)104 4g g以下以下, ,用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等分离；用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等分离；2 2、高速（冷冻）离心机、高速（冷冻）离心机 1×10 1×104 4-2.5×10-2.5×104 4rpmrpm，相对离心力，相对离心力10104 4~10~105 5g,g,用于沉淀、细胞器等分离；用于沉淀、细胞器等分离；3 3、超速离心机、超速离心机 转速转速2.52.5-8×10-8×104 4rpmrpm，，相对离心力相对离心力5*105*105 5g g；用；用于于DNADNA、、RNARNA蛋白质及细胞器病毒分离纯化；检测纯度；沉降系蛋白质及细胞器病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。

数和相对分子量测定等l分制备用、分析用、制备及分析用三种分析用超速离心机分制备用、分析用、制备及分析用三种分析用超速离心机装有光学检测系统、自动记录系统、数据处理系统；装有光学检测系统、自动记录系统、数据处理系统；一、离心机的种类与用途一、离心机的种类与用途酶的分离纯化最新台式高、台式高、超速离心超速离心机机0.6-100.6-10万万转转/ /分以分以上上离心机离心机制备性制备性分析性分析性分析性超速离心机分析性超速离心机普通离心机普通离心机冰冻离心机冰冻离心机台式（或地台式（或地面式）普通面式）普通离心机离心机大容量冰大容量冰冻离心机冻离心机小于小于0.60.6万万转转/ /分分高速冰冻高速冰冻离心机离心机0.6-2.50.6-2.5万万超速冰冻超速冰冻离心机离心机2.5-82.5-8万或万或更高更高( (分析性超速离心主要用于分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特检测大分子物质的沉降特征和结构等征和结构等) )概述概述酶的分离纯化最新酶的分离纯化最新酶的分离纯化最新酶的分离纯化最新所分离的颗粒大小和密度相差较大所分离的颗粒大小和密度相差较大: :常速、高速离心常速、高速离心; ;若从样品液中分离若从样品液中分离2 2种以上大小和密度不同的颗粒：差速离心种以上大小和密度不同的颗粒：差速离心; ;超速离心超速离心: :差速离心法和密度梯度离心法，后者又分速率区带离差速离心法和密度梯度离心法，后者又分速率区带离心和等密度离心。

心和等密度离心二、离心方法的选用二、离心方法的选用1、差速离心、差速离心采用不同离心速度与时间，使不同沉降速度的颗采用不同离心速度与时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离；粒分批分离；酶的分离纯化最新已破碎的细胞已破碎的细胞￿￿￿￿￿￿￿￿沉淀（细胞核）沉淀（细胞核）￿￿￿￿￿￿￿￿上清液上清液￿ ￿沉淀（细胞膜碎片、沉淀（细胞膜碎片、线粒体、溶酶体）线粒体、溶酶体）￿￿￿￿￿￿￿￿上清液上清液￿ ￿沉淀（核糖核蛋白体）沉淀（核糖核蛋白体）￿￿￿￿￿￿￿￿上清液（可上清液（可溶性组分）溶性组分）500500g,10’10￿00010￿000g,10’100￿￿000100￿￿000g,3h酶的分离纯化最新2、密度梯度离心、密度梯度离心又称又称速率速率——区带离心区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法；沉降系数较接近的物质分离的方法；原理原理：：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法域上形成区带的方法介质梯度应预先形成，介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。

介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度常用的有蔗糖、甘油；常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；度梯度；操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带；度液中形成若干条界面清楚的不连续区带；可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分密密度度升升高高酶的分离纯化最新3、等密度离心、等密度离心原理原理：：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离；；区别区别:离心介质、密度梯度范围与密度梯度离心不同，离心介质、密度梯度范围与密度梯度离心不同，欲分离的颗粒欲分离的颗粒密度处于离心介质密度范围内。

密度处于离心介质密度范围内介质有：氯化铯、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等介质有：氯化铯、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等操作：介质溶液与样品液混合均匀，足够时间离心操作：介质溶液与样品液混合均匀，足够时间离心介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，装入离心管，通过离心形成梯度通过离心形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配让颗粒在梯度中进行再分配常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒密密度度梯梯度度酶的分离纯化最新低速离心用低速离心用rpmrpm表示，表示，高速、超高速离心用相对离心力（高速、超高速离心用相对离心力（RCFRCF））表示三、离心条件的确定三、离心条件的确定1 1、离心力、离心力离心力离心力离心加速度离心加速度相对离心力相对离心力（（RCF））酶的分离纯化最新2 2、离心时间、离心时间不同离心方法，离心时间的概念不同不同离心方法，离心时间的概念不同对常数离心、高速离心、差速离心对常数离心、高速离心、差速离心, ,指颗粒完全指颗粒完全沉降到离心管底的时间沉降到离心管底的时间, ,沉降时间或澄清时间沉降时间或澄清时间; ;等密度梯度离心等密度梯度离心, ,指颗粒完全到达等密度点时平指颗粒完全到达等密度点时平衡时间，衡时间，平衡时间平衡时间; ;对密度梯度对密度梯度, ,指形成界限分明区带的时间，指形成界限分明区带的时间，区带区带形成时间形成时间; ;酶的分离纯化最新沉降时间沉降时间沉降系数已知颗粒沉降系数已知颗粒效率因子效率因子KS S：沉降系数；：沉降系数；ωω: :角速度；角速度；r1r1，，r2:r2:转轴中心到液面与管底距离。

转轴中心到液面与管底距离K K与转子半径和转速有关；与转子半径和转速有关；实际操作中：实际操作中：1 1，某一颗粒，某一颗粒S S定值，故定值，故K K小，小，t t也小，效率高（转子的选择）；也小，效率高（转子的选择）；2,2,转子与离心机确定，具体颗粒而言，转子与离心机确定，具体颗粒而言，ωω2 2t t是常数，故可调整是常数，故可调整ωω与与t t得相同效果得相同效果指颗粒从样品液面完全沉降到离心管底所需的时间指颗粒从样品液面完全沉降到离心管底所需的时间; ;决定于沉降速度和沉降距离决定于沉降速度和沉降距离酶的分离纯化最新一般为一般为4 4o oC C稳定性好的酶，可取室温；稳定性好的酶，可取室温；超高速离心需冷冻超高速离心需冷冻pHpH值应处于酶稳定的值应处于酶稳定的pHpH范围3 3、温度和、温度和pH值值酶的分离纯化最新第五节第五节 过滤与膜分离过滤与膜分离过滤过滤 借助过滤介质将大小不同，形状不同的物借助过滤介质将大小不同，形状不同的物质分离的技术质分离的技术介质有滤纸、纤维、陶瓷、高分子膜等介质有滤纸、纤维、陶瓷、高分子膜等以膜为过滤介质的过滤称以膜为过滤介质的过滤称膜分离膜分离技术；技术；微滤、超滤、反渗透、透析、电渗析都属微滤、超滤、反渗透、透析、电渗析都属于膜分离技术于膜分离技术酶的分离纯化最新表表4-4￿￿￿￿￿过滤的分的分类与特性与特性（（P112）） 类别类别 截留的颗粒大小截留的颗粒大小 主要物质主要物质 过滤介质过滤介质粗滤粗滤>2>2umum酵母、霉菌、动植物细酵母、霉菌、动植物细胞、固形物胞、固形物滤纸、滤布、纤滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷维、多孔陶瓷微滤微滤0.2~20.2~2umum细菌、灰尘细菌、灰尘微滤膜微滤膜超滤超滤2020A~0.2umA~0.2um病毒、生物大分子病毒、生物大分子超滤膜超滤膜反渗透反渗透<20<20A A生物小分子、生物小分子、盐、离子盐、离子反渗透膜反渗透膜酶的分离纯化最新一、非膜过滤一、非膜过滤截留颗粒直径大于截留颗粒直径大于2 2μμm,m,用于分离酵母、霉菌、动植物细胞、培用于分离酵母、霉菌、动植物细胞、培养基残渣等。

过滤介质有滤纸、滤布、多孔陶瓷等养基残渣等过滤介质有滤纸、滤布、多孔陶瓷等1)(1)常压过滤常压过滤以液位差为推动力，易操作，分离效果差，难成规模以液位差为推动力，易操作，分离效果差，难成规模2)(2)加压过滤加压过滤以压力泵或压缩空气为推动力效果较好，生产上应用广泛以压力泵或压缩空气为推动力效果较好，生产上应用广泛3)(3)减压过滤减压过滤真空过滤、抽滤多用于粘性不大的物料真空过滤、抽滤多用于粘性不大的物料1 1、粗滤、粗滤2 2、微滤、微滤l微孔过滤微孔过滤, ,截留颗粒直径截留颗粒直径0.20.2～～2 2μμm m，光学显微镜可见，光学显微镜可见颗粒，采用微孔陶瓷、微滤膜等颗粒，采用微孔陶瓷、微滤膜等酶的分离纯化最新二、膜分离技术二、膜分离技术借助于一定孔径的各种借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大高分子薄膜，将不同大小、不同性状和不同特小、不同性状和不同特性的物质颗粒或分子分性的物质颗粒或分子分离的技术薄膜有丙烯离的技术薄膜有丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、赛璐玢及尼龙纤维素、赛璐玢及尼龙等高分子聚合物制成的等高分子聚合物制成的高分子膜高分子膜酶的分离纯化最新以薄膜两边的流体静压差为推动力；以薄膜两边的流体静压差为推动力；根据截留的颗粒大小可分为根据截留的颗粒大小可分为3 3种；种；MEF微滤器微滤器根据颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力不同分三类。

根据颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力不同分三类1 1）微滤）微滤截留的物质颗粒直径为截留的物质颗粒直径为0.20.2～～2 2umum，，操作压力操作压力0.10.1MPaMPa以以下1 1、加压膜分离、加压膜分离酶的分离纯化最新(2)(2)超滤超滤截留的物质颗粒直径截留的物质颗粒直径为为2020～～20002000Å（（0.2um0.2um））；可同时截；可同时截留菌丝体和可溶性蛋白留菌丝体和可溶性蛋白 操作压力操作压力5050～～700700KPaKPa；；特别适于液体酶制剂的生产；特别适于液体酶制剂的生产；对需要辅酶的酶的生产不适用；对需要辅酶的酶的生产不适用；SHM系列膜分离装置系列膜分离装置【【截留分子量截留分子量】】：：300～～50000道尔顿；道尔顿；【【操作压力操作压力】】：：0.1～～02Mpa【【操作温度操作温度】】：：20～～50℃￿ ￿在发酵行业中，由于传统分离工艺技术条件的限制，预处理中在发酵行业中，由于传统分离工艺技术条件的限制，预处理中常有常有5-15%5-15%的产品损失，大量的可溶性蛋白、大分子杂质被带入的产品损失，大量的可溶性蛋白、大分子杂质被带入到下游工序，增加了后提取工艺的环节和负荷，影响产品质量到下游工序，增加了后提取工艺的环节和负荷，影响产品质量及生产收率。

及生产收率Ultra-floUltra-flo超滤分离技术彻底突破这一技术瓶颈超滤分离技术彻底突破这一技术瓶颈酶的分离纯化最新(3)(3)反渗透反渗透反渗透（反渗透（RORO）是膜分离技术的一）是膜分离技术的一个重要组成部分个重要组成部分 膜孔径小于膜孔径小于20 20 Å ，，操作压力为操作压力为0.70.7～～1313MPaMPa 用于海水淡化用于海水淡化在水过滤时利用反渗透膜的选择在水过滤时利用反渗透膜的选择性透过原理，通过设备的高压泵性透过原理，通过设备的高压泵对经过反渗透膜的原水施加一定对经过反渗透膜的原水施加一定压力，在压力作用下原水中的水压力，在压力作用下原水中的水分子可以透过膜而渗析出来，而分子可以透过膜而渗析出来，而其他无机盐、微生物与有机物等其他无机盐、微生物与有机物等却由于反渗透膜对这些物质的截却由于反渗透膜对这些物质的截留特性而不能透过膜，从而可以留特性而不能透过膜，从而可以获得纯净的无离子水获得纯净的无离子水 酶的分离纯化最新（（2）离子交）离子交换膜膜电渗析渗析2 2、电场膜分离、电场膜分离在半透膜的两侧分别装上正负极，电场作用下小在半透膜的两侧分别装上正负极，电场作用下小分子带电物或离子向与其本身电荷相反的电极移分子带电物或离子向与其本身电荷相反的电极移动，透过半透膜，达到分离目的。

动，透过半透膜，达到分离目的1 1）电渗析）电渗析样品液样品液缓冲液如图如图离子交换膜代替一般膜离子交换膜代替一般膜酶的分离纯化最新主要指透析；利用小分子主要指透析；利用小分子扩散作用透过半透膜，而扩散作用透过半透膜，而大分子被截留；用于酶、大分子被截留；用于酶、蛋白质、核酸等生物大分蛋白质、核酸等生物大分子的分离透析设备简单，子的分离透析设备简单，但操作时间长，要更换水但操作时间长，要更换水或缓冲液或缓冲液3 3、扩散膜（透析）膜分离、扩散膜（透析）膜分离膜公司网站膜公司网站Back酶的分离纯化最新酶的分离纯化最新。