盐地碱蓬液泡膜Calt2gt主动运输体及其在耐盐性中的作用.pdf

独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意学位论文作者签名一 导师签字：多互、山学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：姊守j ，’ 导师签字：多分．≥签字同期：2 0 0 年月日签字日期：2 0 0年月日m 东师范大学博士学位论文盐地碱蓬液泡膜C a ”主动运输体及其在耐盐性中的作用 韩宁( 山东师范大学生命科学学院，济南，2 5 0 0 1 4 )摘要盐分胁迫主要包括渗透胁迫及离子胁迫渗透胁迫、离子胁迫及其造成的一系列次级胁迫如氧化胁迫等，严重干扰植物体内业已存在的细胞及整株水平上的水分及离子稳态，造成植物细胞分子损伤，生长减缓甚至死亡。

植物对盐胁迫的反应是由复杂的信号转导系统介导完成的其中胞质中c a 2 + 作为第二信使对盐刺激信号起传递和放大作用c a 2 + 信号主要是胞质中C a 2 + 水平的波动，其波动的幅度及持续的时间决定植物对刺激的反应因此，植物胞质c a 2 + 稳衡态的维持对N a + 外排或区域化非常关键植物主要利用C 矿通道、c a 2 + 转运体等来精确控制胞质C a 2 + 水平，维持胞质中的c a 2 + 的稳态本实验以典型的积盐型盐生植物盐地碱蓬为材料，分两部分探讨了盐胁迫下液泡膜C a ”- A T P a s e 、C a 2 + ／H + a n t i p o r t e r 和H + - A T P a s e 在植物抗盐中的作用第一部分主要是对盐地碱蓬进行C a 2 + 、N a +处理，测定有关生理指标及液泡膜旷．A T P a s e 、Ca _ H ．A T P a s e 活性并对H + ．A T P a s e进行W e s t e r n - b l o t 免疫杂交第二部分主要是克隆了盐地碱蓬液泡膜C a 2 + ／H + a n t i p o r t e r 的基因S s C A X t 并进行表达特性分析，同时构建了含有S s C A X t的酵母表达载体和植物表达载体分别转化酵母突变体K 6 6 7 和拟南芥，以分析此基因的主要功能及过量表达对拟南芥耐盐性的影响，其主要结果如下：1 ．C a 2 + 、N a + 处理对盐地碱蓬生长的影响赫对盐地碱蓬生长的影响依赖于根际C a 2 + 供给水平。

c a 2 + 供应充分的条件下，N a C I 处理使植株相对生长量明显增加但在C a 2 + 处理浓度为0m m o l ／L 情况下，N a C l 处理对整株植物的生长无显著作用说明了N a + 对盐地碱蓬生长的促进作用依赖于一定浓度的外源c a z + 2 ．c a 2 + 、N a + 处理对盐地碱蓬叶片K + 、N 一、c a 2 + 等无机离子含量的影响盐地碱蓬叶片细胞汁液K + 、c a 2 + 浓度随盐处理浓度的增大面降低，细胞汁液N a + 浓度变化则相反但在缺c a 2 + 培养条件下，细胞汁液K + 、C a 2 + 浓度随盐处理浓度升高而下降的幅度明显大于高c a 2 + 培养条件下( P O ．1 ) ．w h e nC a 2 + 1 e v e l i nt h en u t r i e n ts o l u t i o nw a s0m m o l ／L ．2 ．E 仃e c t so fC a 2 + o nN a + ．K + ．a n dC a 2 + c o n c e n t r a t i o n si n1 e a fe e l ls a po fS u a e d as a l s as e e d l i n g su n d e rN a C lt r e a t m e n t K + a n dC a 2 + c o n c e n t r a t i o n si nl e a fe e l ls a pw e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fN a c lc o n c e n t r a t i o nf P O ．1 ) 。

口0 m m 帆N a C i t团1 0 0 m m o ⅣL N a C Ic a cr 2 ( m m o I 几)4 0 0m m o l ／LN a C I864j∞鲁％n bLI篆J6}曼∞芷山东缔范大学搏±学位论文图7 盐处理条件下c a 2 + 对盐地碱蓬相对生长量的影响图中数据为5 个重复的平均值士S D ，+ 和‘t 分别代表P 0 ．0 5 ) 而根际C a 2 + 供应充足( 2 0m m o l ／L ) 时，用1 0 0 、4 0 0m m o l ／LN a C t 处理后v - 一一A T P a s e 活性都明显比对照高3 02 41 81 2苟6 旦 罟 20OC a C l 2 ( r r r n 0 I ／L )口0m r r t o l ／LN a C l ．团1 0 0m m o l ，LN a C I困4 0 0m m o l ／LN a C I—LrL也啊E『!n五E3扫堇芍叮∞∞毋乱上v山东卿范大学博士学位论文图9 盐处理条件下C a 2 十对盐地碱蓬叶片液泡膜、L H + - A T P a s e 活性的影响图中数据为9 个重复的平均值士S D ，} ，·‘和{ { + 分别代表P 0 ．0 5 ) 。

但是，有C d + 培养条件下盐处理比无C a 2 + 培养条件下的V - C a 2 + - A T P a s e 活性高口0 N a C 】囡I O O N a C I目4 0 0 N a C l02 0C a C l 2 ( m m o l ／L )图1 0c a 2 十、N r 处理对盐地碱蓬叶片液泡膜C a 2 ％A T P a s e 活性的影响图中数据为9 个重复的平均值士S DF i g ．1 0 ．E f f e c to fc d + o na c t i v i t yo fl e a ft o n o p l a s tc a 2 + - A T P a s eo fS u a e d as a l s ap l a n t su n d e r0m m o l ／LN a C I1 0 0m m o l ／LN a C I ，a n d4 0 0m m o l ／LN a C It r e a t m e n t ．D a t aa r em e a n s ( n - 9 ) o f t h r e ei n d e p e n d e n te x p e r i m e n t s ±S D ．4 ．3V - I I + ．A T P a s e 亚基蛋白量S D S —P A G E 电泳后，用v ．H + ．A T P a s e 抗体A T P 9 5 对盐地碱蓬液泡膜微囊蛋白样品进行免疫杂交发现：在缺c a 2 十培养条件下，无论盐处理还是非盐处理均无诱导V - H + - A T P a s e 新亚基的出现，v - H + ．A T P a s e 的亚基A ( 6 6k D ) 、B ( 5 5k D ) 、D 0 6 k D ) 、V o 部分的“1 8 k D ) 亚基的表达在4 0 0 m m o l ／L N a C i 处理后与对照比无显著变化，仅在10 0m m o l ／LN a C l 处理后稍有增加。

在2 0m m o l ／Lc a 2 十培养条件下盐处理也无诱导v - H + 一A T P a s e 新亚基的出现，但v - A r P a s e 的亚基B 和V o 部分的c 亚基的表达均随盐处理的增加而明显增加而且V - A T P a s e 亚基A 、B 、D和c 的数量在有c a 2 + 条件下比无c a 2 十条件下的多( 图1 1 ) 矗厘营加¨如0一‘．h山Ⅻ5＼“山'【og；一∞o}日∞_Ih oh__；}一一o∞m∞o(1卜《．☆ou，>山东瓣范大学博壬学位论文图l lC a 2 + 、N a + 处理对盐地碱蓬叶片液泡膜微囊蛋白W e s t e r n b l o t 分析图左边字母代表v - H f - A T P a s e 的Ⅱ基A ，B ，D 和C ，图右边代表蛋白分子量泳道a ：0m m o V Lc a ”／0 m m o l 儿N a C l 处理；b ：0 m m o l ／L c a 2 + ／1 0 0 m m o L ／L N a C I 处理；c ：0 m m o l ／L c 一／4 0 0 m m o l F L N a C I 处理；d ：2 0 m m o l ／L c a “ + ／0 m m o l , ' L N a C I 处理：e ：2 0 m m o l ／L C a 2 十，1 0 0m m o l 几N a C l 处理；f ：2 0 m m o l ／L C 一+ ／4 0 0 m m o l ／L N a C I 处理。

F i g ．1 1 ．W e s t e r nb l o ta n a l y s i so ft o n o p l a s tv e s i c l ep r e p a r a t i o n si s o l a t e df r o mS u a e d as a l s a ] e a v e se x p o s e dt od i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fN a C I1 4d a y su n d e r0m m o l 几a n d2 0m m o ] I ／LC 一+ ．1 m m u n o s t a i n i n gw a sp e r f o r m e du s i n ga n t i s e r u mA T P 9 5 ．L e t t e r so nt h el e f tm a r g i ni n d i c a t et h ep o s i t i o no f s u b u n i tA ，B ，Da n dc ．N u m b e r so nt h er i g h ti n d i c a t et h em o l e c u l a rm a s s e so f s u b a n i t s ．L a n ea ：0m m o l ／Lc a 2 + ／0m m o l ／LN a C It r e a t m e n t ；l a n eb ：0m m 0 1 ／Lc a 2 + ／10 0m m o I ／LN a C It r e a t m e n t ；l a n ec ：0m m o l ／Lc a 2 + ，4 0 0m m o ／／LN a C It r e a t m e n t ；l a n ed ：2 0m m o l ／Lc a 2 + ／0m m o l ／LN a C It r e a t m e n t ；l a n ee ：2 0m m o l ／Lc d + ／1 0 0m m o l ／LN a C It r e a t m e。