【实验】微生物的分离与纯化课件.ppt

微生物的分离与纯化微生物的分离与纯化实验操作实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基计算－称量－溶化－灭菌－倒平板计算－称量－溶化－灭菌－倒平板1.计算计算2.称量称量牛肉膏比较粘稠，可以用牛肉膏比较粘稠，可以用_____挑取，放挑取，放在在_______上称量牛肉膏和蛋白胨都容上称量牛肉膏和蛋白胨都容易易___，称取时动作要，称取时动作要____，称后要及时，称后要及时__________玻璃棒玻璃棒称量纸称量纸吸潮吸潮迅速迅速盖上瓶盖盖上瓶盖二、实验操作二、实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基3.溶化溶化Q:溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中中,减少误差减少误差Q：加琼脂的目的是什么：加琼脂的目的是什么?作为凝固剂作为凝固剂Q: 熔化琼脂时为什么不断用玻棒搅拌？熔化琼脂时为什么不断用玻棒搅拌？防止琼脂糊底而导致烧坏破裂防止琼脂糊底而导致烧坏破裂计算－称量－溶化－灭菌－倒平板计算－称量－溶化－灭菌－倒平板二、实验操作二、实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基4.灭菌灭菌Q：在灭菌前：在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？基的锥形瓶的目的是什么？在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞,在取出在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用作用Q：培养皿能否用高压蒸汽灭菌？：培养皿能否用高压蒸汽灭菌？不能不能,因为培养皿要保持干燥因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌。

应该用干热灭菌计算－称量－溶化－灭菌－倒平板计算－称量－溶化－灭菌－倒平板二、实验操作二、实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基5.倒平板倒平板待培养基冷却至待培养基冷却至_______左右时，在左右时，在_________________倒平板50℃℃酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近Q：培养基灭菌后，需要冷却到：培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃℃左右时，左右时，才能用来倒平板才能用来倒平板 为什么？为什么？温度过高的时候倒平板，会在培养基表面形成温度过高的时候倒平板，会在培养基表面形成大量冷凝水，影响使用温度过低的时候倒平大量冷凝水，影响使用温度过低的时候倒平板，有可能琼脂已经凝固板，有可能琼脂已经凝固计算－称量－溶化－灭菌－倒平板计算－称量－溶化－灭菌－倒平板二、实验操作二、实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基5.倒平板倒平板待培养基冷却至待培养基冷却至_______左右时，在左右时，在_________________倒平板50℃℃酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近Q：培养基灭菌后，需要冷却到：培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃℃左右时，左右时，才能用来倒平板。

你用什么办法来估计培养基才能用来倒平板你用什么办法来估计培养基的温度？的温度？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了行倒平板了计算－称量－溶化－灭菌－倒平板计算－称量－溶化－灭菌－倒平板倒平板技术倒平板技术1.将灭过菌的将灭过菌的培养皿放在培养皿放在______的桌面的桌面上，上，______拿拿装有培养基的装有培养基的锥形瓶，左手锥形瓶，左手________1234火焰旁火焰旁右手右手拨出棉塞拨出棉塞倒平板技术倒平板技术12342.右手拿锥形瓶，使右手拿锥形瓶，使瓶口瓶口______________迅速通过火焰迅速通过火焰Q:为什么需要使锥形为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培瓶口的微生物污染培养基倒平板技术倒平板技术12343.用左手的拇指用左手的拇指和食指将培养皿和食指将培养皿打开打开_______________的缝隙，右手将的缝隙，右手将锥形瓶中的培养锥形瓶中的培养基基(约约10~20mL)倒入培养皿，左倒入培养皿，左手立即手立即_____________________。

一条稍大于瓶口一条稍大于瓶口培养皿的皿盖培养皿的皿盖盖上盖上倒平板技术倒平板技术12344.等待平板等待平板________，大，大约需约需_________然后，将平板将平板____________，，使皿盖在下，皿底在上使皿盖在下，皿底在上冷却凝固冷却凝固5~10min倒过来放置倒过来放置Q:这么做的目的是什么？这么做的目的是什么？平板冷凝后，皿盖上会凝结水平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染水珠落入培养基，造成污染Q：在倒平板的过程中，如果不小心将培：在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？平板还能用来培养微生物吗？为什么？问题讨论问题讨论空气中的微生物可能在皿盖与皿空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。

好不要用这个平板培养微生物（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌微生物的接种的微生物的接种的常用接种方法有常用接种方法有：：平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法 平板划线法平板划线法: :通过通过接种环接种环在琼脂固体在琼脂固体培养基表面培养基表面连续划线连续划线的操作，将聚集的菌种的操作，将聚集的菌种逐步逐步稀释分散稀释分散到培养基的表面到培养基的表面 在数次划线后，可以分离到在数次划线后，可以分离到由一个细胞繁由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落菌落1.1.平板划线法平板划线法平板划线的操作平板划线的操作Q:为什么在操作的第一为什么在操作的第一步要灼烧接种环？步要灼烧接种环？为了避免接种环上为了避免接种环上可能存在的微生物可能存在的微生物污染培养物污染培养物平板划线的操作平板划线的操作Q:在灼烧接种环之后，在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却？为什么要等其冷却？以免接种环温度以免接种环温度太高，杀死菌种太高，杀死菌种平板划线的操作平板划线的操作通过灼烧灭菌，防止通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染菌瓶口的微生物污染菌液。

液Q:为什么要将试管口为什么要将试管口通过火焰？通过火焰？平板划线的操作平板划线的操作注意：沾完菌注意：沾完菌液后不是立即液后不是立即在试管口塞上在试管口塞上棉塞，而是先棉塞，而是先将试管口通过将试管口通过火焰平板划线的操作平板划线的操作 一旦划破，会造成一旦划破，会造成划线不均匀划线不均匀，，难以达难以达到分离单菌落的目的到分离单菌落的目的；； 二是存留在划破处的单个细胞二是存留在划破处的单个细胞无法形成无法形成规矩的菌落规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落成一个条状的菌落平板划线的操作平板划线的操作Q:Q:为什么每次划线之前为什么每次划线之前都要灼烧接种环？都要灼烧接种环？每次划线前灼烧接种环是每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种接种环上残留的菌种，使，使下一次划线时，接种环上下一次划线时，接种环上的菌种的菌种直接来源于上次划直接来源于上次划线的末端线的末端，从而通过划线，从而通过划线次数的增加，使每次划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。

以便得到菌落平板划线的操作平板划线的操作Q:Q:在作第二次以及其后在作第二次以及其后的划线操作时，为什么的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末总是从上一次划线的末端开始划线？端开始划线？划线后，线条末端细菌划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要的数目比线条起始处要少，少，每次从上一次划线每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的的数目随着划线次数的增加而逐步减少增加而逐步减少，最终，最终能能得到由单个细菌繁殖得到由单个细菌繁殖而来的菌落而来的菌落平板划线的操作平板划线的操作Q:Q:在划线操作结束时，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗仍然需要灼烧接种环吗？为什么？？为什么？划线结束后需要灼烧接种环，划线结束后需要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的能及时杀死接种环上残留的菌种，菌种，避免细菌污染环境和避免细菌污染环境和感染操作者感染操作者平板划线法平板划线法平板划线的平板划线的操作方法操作方法2 2、稀释涂布平板法、稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的将菌液进行一系列的梯度稀释梯度稀释，然，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体固体培养基培养基的表面，进行培养。

的表面，进行培养稀释涂布平板法稀释涂布平板法梯度稀释菌液梯度稀释菌液分别（依次）涂布平板分别（依次）涂布平板　　　　1.将分别盛有将分别盛有9mL水的水的6支试管灭菌，支试管灭菌，并按并按101~106的顺序编号的顺序编号梯度稀释菌液梯度稀释菌液注意：注意： 移液管需要经过移液管需要经过灭菌操作时，试管口和灭菌操作时，试管口和移液管离火焰移液管离火焰1~2cm处处.　　　　1.将分别盛有将分别盛有9mL水水的的6支试管支试管灭菌灭菌，，并按并按101~106的顺序编号的顺序编号梯度稀释菌液梯度稀释菌液2.用移液管吸取用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第培养的菌液，注入第二支试管中用手指轻压移液管上的橡皮二支试管中用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀梯度稀释菌液梯度稀释菌液3.从从101倍稀释的试管中吸取倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注稀释液，注入入102倍稀释的试管中，重复第倍稀释的试管中，重复第2步的操作步的操作依次类推，直到完成最后一支试管的稀释依次类推，直到完成最后一支试管的稀释梯度稀释菌液梯度稀释菌液涂布平板涂布平板 涂布平板的所有操作都应在火焰附涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。

结合平板划线与系列稀释的无近进行结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第菌操作要求，想一想，第2步应如何进行步应如何进行无菌操作？无菌操作？ 应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无菌无菌”例如，酒精灯与培养皿的距离要例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等吸管要在酒精灯火焰周围等等问题讨论问题讨论（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌微生物的接种的微生物的接种的常用接种方法有常用接种方法有：：平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法（三）（三）将将接种后的培养基接种后的培养基和和一个未接种一个未接种的培养基的培养基放入放入37℃恒温箱中培养恒温箱中培养12h和和24h后，观察并记录后，观察并记录将将未接种的培养基未接种的培养基放在恒温箱培养的放在恒温箱培养的目的是目的是 验证培养基灭菌是否彻底验证培养基灭菌是否彻底二、实验操作二、实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基菌种的保存菌种的保存1.临时保藏：临时保藏： 接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后置养基，菌落长成后置于于4℃冰箱保存。

冰箱保存2.长期保存：长期保存： 甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法三、课题成果评价三、课题成果评价 （一）（一）培养基的制作培养基的制作是否合格是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中如果未接种的培养基在恒温箱中保温保温1～～2 d后无菌落生长，说明培养后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新基的制备是成功的，否则需要重新制备 （二）（二）接种操作接种操作是否符合无菌要求是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习求，需要分析原因，再次练习（三）是否进行了及时细致的观察与记录（三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养培养12 h与与24 h后的大肠杆菌菌落的后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。

这一步的要求主要是培养学生良的变化这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯好的科学态度与习惯练习练习2:•1.获得纯净培养物的关键是•A 将用于微生物培养的器皿.接种用具和培养基等器具进行灭菌•B 接种纯种细菌•C 适宜环境条件下培养•D 防止外来杂菌的入侵•2.下列操作与无菌技术无关的是•A 接种前用肥皂洗双手,再用酒精擦拭双手•B 接种前用火焰烧灼接种针•C 培养在50℃左右时搁置斜面•D 在酒精灯的火焰旁完成•3.外科手术器械和罐头食品的处理,要以能够杀死什么为标准•A 球菌 B 杆菌 C 螺旋菌 D 芽孢DCD 4.某学校打算开辟一块食用菌栽培基地某学校打算开辟一块食用菌栽培基地,以丰富学生以丰富学生的劳动技术课内容的劳动技术课内容,首先对食用菌实验室进行清扫和首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理消毒处理,准备食用菌栽培所需的各种原料和用具准备食用菌栽培所需的各种原料和用具,然然后从菌种站购来各种食用菌菌种后从菌种站购来各种食用菌菌种.请回答以下问题请回答以下问题:(1)对买回来的菌进行扩大培养,首先制备试管培养基,写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料 。

其中提供氮源的主要 是 ；提供能源的主要物质是 ；琼脂的作用是 ，它不提供营养2)微生物在生长过程中对各种成分所需量不同,故制备培养基时各成分要有合适的 ,在烧杯加入琼脂后要不停地 ,防止 .牛肉膏、蛋白胨、水、无机盐、琼脂牛肉膏、蛋白胨、水、无机盐、琼脂牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨凝固剂凝固剂比例比例搅拌搅拌琼脂糊底引起烧杯破裂琼脂糊底引起烧杯破裂(3)将配制好的培养基转移到锥形瓶中,加棉塞后包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入 中灭菌,压力为 ,温度为 ,时间 ,灭菌完毕拔掉电源,待锅内压力 ,将试管取出. (4)使用高压蒸汽灭菌锅时注意,先向锅内倒入 ,把锅内水加热煮沸并将基中原有冷空气彻底排除后将锅密闭.(5) 从一支试管向另一支试管接种时注意,接种环要在酒精灯 焰灭菌.并且待接种环 后沾取菌种,试管口不能离开酒精灯火焰附近,将接种的试管放入 ℃冰箱中保藏.高压灭菌锅高压灭菌锅100KPa121 ℃自然降至零后自然降至零后 适量水适量水外外冷却冷却415---30min。