胸腔积液蛋白质图谱差异及其临床意义初探.doc

KKME---专业医学搜索引擎 作者单位：广州市红十字会医院 呼吸内科; 医学实验中心，广东 广州 510220【摘要】 目的 探讨表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术 (SELDI TOF MS 技术)对胸腔积液鉴别诊断的价值方法 用 SELDI TOF MS 技术检测 33 例诊断明确的胸水标本及部分相应血清标本 结果 良恶性胸腔积液组血清标本蛋白信号无明显差别，但胸液标本有 6 个蛋白信号有差异；胸液中存在的 M3945.52 Da、 M8944.86 Da 蛋白差异对渗出性胸液的良恶性判断有鉴别价值；漏出性胸液及其相应血清标本蛋白含量和成分差异较大，无分析价值结论 SELDI TOF MS 技术对渗出性胸腔积液的良恶性鉴别有实用前景关键词】 胸腔积液 良恶性 生物学标记 质谱法 SELDI TOF MS 技术胸液分析是对胸腔积液进行鉴别诊断的重要内容目前进行的胸液分析主要有显微镜检查、生化分析、酶活性测定、免疫学检查以及细胞学检查等，但存在敏感性、特异性或鉴别效能等方面问题［1-4 ］ 表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术 (SELDI TOF MS) 是一种可直接检测相对原始生物样品的高效、高通量、高灵敏度的蛋白质组学研究技术平台，也是目前进行比较蛋白质组学研究的核心技术［5］ 。

笔者使用 SELDI TOF MS 技KKME---专业医学搜索引擎 33 例诊断明确的胸腔积液患者胸水标本及部分相应血清标本，比较其蛋白质成分异同，以探讨其临床价值1 对象与方法1.1 诊断标准(1) 癌性渗出性胸腔积液: 胸水生化检查符合 Light 渗出液标准，胸液细胞学检查发现肿瘤细胞，同时存在原发肿瘤病灶的证据；(2) 良性渗出性胸腔积液:临床上缺乏恶性胸腔积液证据，胸水生化检查符合 Light 渗出液标准，经相应治疗后胸液吸收同时随访半年以上无复发；（3）漏出液：临床存在心衰、肝硬化、低蛋白血症等情况，胸水生化检查符合 Light 漏出液标准1.2 对象共 33 例胸水病人，其中男性 24 例，女性 9 例；年龄22～90 岁胸水生化检查符合 Light 渗出液标准 27 例，其中良性胸腔积液组 13 例，男 10 例,女 3 例,年龄 22～69 岁恶性胸腔积液组14 例，其中男 11 例,女 3 例,年龄 42～90 岁；原发肿瘤分别为肺癌、胸膜间皮瘤、鼻咽癌；胸液中找到腺癌细胞 4 例、间皮瘤细胞 2 例、低分化腺癌、黏液腺癌及小细胞癌各 1 例、不能确定细胞类型 5 例。

符合漏出液标准 6 例，其中男性 3 例,女 3 例,年龄 56～75 岁1.3 标本获取及处理方法KKME---专业医学搜索引擎 1 次或第 2 次胸腔穿刺时留取 5 mL 胸液标本，2 h 内以 3 500 r/min 低温离心 10 min 分离出上清液后置-80 ℃冰箱保存备测；同时抽取 5 mL 静脉血以同样方式离心分离出血清后置-80 ℃冰箱保存备测1.4 主要仪器和试剂检测所用的 PBSIIc 型 SELDI TOF MS 仪及 WCX2 型弱阳离子蛋白质芯片由美国 Ciphergen 公司生产；所用的主要试剂有：尿素；2mmol/L Tris HCl pH9（Sigma 公司） ；乙腈（acetonitrile, ACN，Sigma 公司） ；三氟乙酸（TFA， Sigma 公司） ；DTT（Sigma公司） ；3 环乙胺 1 1 丙磺酸（CHAPS，Sigma 公司） ；SPA（Sinapic acid, for MALDI MS, for mass spectroscopy，瑞士Fluka 公司） 1.5 检测方法及步骤1.5.1 胸积液和血清样品的预处理 (1）从-80 ℃冰箱中取出样品，室温快速溶解；(2）取样品 3 ΜL，用 6 ΜL U9 缓冲液稀释，冰浴 30 min；(3）稀释样品中加入 108 ΜL WCX2 结合缓冲液，混匀即可。

1.5.2 蛋白质芯片的制备 (1）将 WCX2 芯片装入芯片处理器，每孔加入 200 ΜL WCX2 结合缓冲液，置摇床 130 r/min，震荡 5 min，吸去缓冲液重复上述操作一次2 ）每孔中加入 100 KKME---专业医学搜索引擎 预处理后的样品，置摇床 130 r/min，震荡 1 h，吸去样品3 ）每孔加入 200 ΜL WCX2 结合缓冲液，置摇床 130 r/min，震荡 5 min，吸去缓冲液重复上述操作一次 (4）每孔加入 200 ΜL HPLC grade 水，稍加振荡，即刻吸出5 ）拆开芯片处理器，取出芯片，风干6）在芯片每点加入 1 ΜL SPA 溶液，风干1.5.3 蛋白质芯片的测定 将制备完成的芯片装入 SELDI质谱仪芯片仓，设置测试条件如下：(1）最高分子量 60 000 Da（道尔顿） ，优化分子量范围：2 500～20 000 Da；(2）激光强度 200（最高 240） ；(3）检测器灵敏度 8（最高 10） ；(4 ）分子量过滤器设于 1 000 Da（滤去 1 000 Da 以下小分子，减弱小分子对检测器的干扰） ；(5）扫描芯片表面 20％～80％部分，步进 4％，每点扫描 7 次；自动收集数据。

1.5.4 共检测 33 例胸液标本，16 例血清标本（良性胸液5 例，恶性胸液 8 例，漏出液 3 例） 非同日分 3 批检测完成1.6 数据分析和统计1.6.1 分类模型的建立 将检测获得的胸液和血清蛋白质指纹图谱用 Ciphergen ProteinChip Software 拉平基线，校正分子量和总离子强度随后使用 Biomarker Wizard Software（Ciphergen 公司）筛选出信噪比大于 4 的信号，将这些信号导出成电子表格文件，再导入 Biomarker Patterns Software（BPS，Ciphergen 公司）进行分类运算，得出分类模型1.6.2 分类模型的灵敏度及特异性分析 利用 BPS 自带的KKME---专业医学搜索引擎 模式功能将建分类模型的数据随机分成两组，一部分建模，一部分做盲测，如此多次随机的测试来计算出现实情况下分类模型的对良恶性胸液判别的灵敏度和特异性2 结果2.1 差异蛋白质峰 根据设置的测试条件，共获得 225 个可供分析的蛋白电离信号比较发现良恶性胸腔积液组血清标本蛋白信号没有明显差别，但胸液标本有 6 个蛋白信号呈现差异，分别是M3164.21、M3945.52、M8944.86、M11340.9、M13573.7、M30917.8 Da 蛋白，其中以 M3945.52、M8944.86 Da 蛋白与胸液分类相关性最为密切，见图 1。

M 恶性胸腔积液 B 良性胸腔积液图 1 良恶性胸腔积液患者 M3945.52、M8944.86 Da 蛋白差异峰（箭头所示) （略）Tab.1 The differences of M3945.52、M8944.86Da protein signals between benign and malignant pleural effusions (arrow）2.2 蛋白质指纹图谱筛选模型 利用 BPS 软件对所获得的蛋白信号资料进行分析后，可分别建立以 M3945.52Da 或M8944.86Da 蛋白为标志物的良恶性胸液蛋白质图谱筛选模型，见图2Class=0 恶性胸腔积液 Class=1 良性胸腔积液 N 样品数 M 分子质量KKME---专业医学搜索引擎 2 利用 BPS 建立的 M3945.52 Da、M8944.86 Da 蛋白图谱筛选模型（略）Tab.2 Proteomic screen pattern of M3945.52 Da、M8944.86 Da established with BPS如图 2 所示，节点（node）1 为根节点，如果胸液样本中分子量为 M3945.52 Da 的蛋白质相对含量≤8.367，则被划入恶性胸腔积液的终节点，反之则划入良性胸腔积液的终节点。

同样，如果胸液样本中分子量为 M8944.86 Da 的蛋白质相对含量≤16.252，则被划入恶性胸腔积液的终节点，反之则划入良性胸腔积液的终节点2.3 判别效能 将具有差异的 6 个蛋白质信号资料分别导入 BPS 软件系统进行分类运算显示：若以胸液中 M3945.52 Da 蛋白相对含量等于 8.367 为界，可将 84.6%的良性胸液样本及 91.8%恶性胸液样本正确识别，其特异性分别为 83.3%、84.6% ；若以胸液中M8944.86 Da 蛋白相对含量等于 16.252 为界，可将 84.6%的良性胸液样本及 78.6%的恶性胸液样本正确识别，其特异性分别为83.3%、76.9%；其他 4 种蛋白的标本分类正确率及特异性均在 50%以下2.4 漏出性胸液6 例漏出性胸液及其相应血清标本蛋白含量和成分差异较KKME---专业医学搜索引擎 讨论胸腔积液的形成与水、钠潴留、低蛋白血症、肺毛细血管压增高、胸膜毛细血管通透性增加、胸膜腔淋巴引流阻塞等有关［1］ 其中水、钠潴留、低蛋白血症、肺毛细血管压增高引起的胸腔积液多为漏出液，临床上病因主要有充血性心力衰竭、肝硬化、肾病综合征等情况；其他情况引起的胸腔积液多为渗出液，临床上病因多种多样，主要有肿瘤性、感染性、化学性、变态反应性等因素。

由于渗、漏出液的病因及形成机理不同，通过对胸液的生化分析，结合临床表现及 Light 判别标准不难将两者鉴别，常不需借助其他鉴别检查手段本研究使用 SELDI TOF MS 技术分析了 6例漏出性胸液蛋白图谱，发现图谱差异巨大，难以进行比较分析，表明 SELDI TOF MS 技术分析漏出液中蛋白质图谱差异应用价值极为有限渗出性胸腔积液的病因分布差异较大，其中肿瘤转移或原发胸膜恶性肿瘤所致的胸腔积液预后较差，一般称之为恶性胸腔积液；其他病因引起的预后较好，则称之为良性胸腔积液目前临床上鉴别良恶性胸液的手段有胸液酶活性测定、免疫学检查、细胞学检查、胸膜活检以及胸腔镜等，其中胸液酶活性测定、免疫学检查、细胞学检查、胸膜活检最为常用，但都存在一定的局限性，文献报KKME---专业医学搜索引擎 10%～17% 的胸腔积液病因不能得到及时诊断［3,4］ ，胸腔镜检查虽然有较高的诊断价值，但开展需要一定技术及设备条件，病人所遭受的痛苦也较大，难以普遍开展，渗出性胸腔积液的病因诊断一直成为临床上具有挑战性的问题SELDI TOF MS 技术又称为蛋白质芯片技术或蛋白指纹技术，由蛋白质芯片系统和质谱仪组成，具有可直接检测血清、尿液、组织和细胞裂解物等原始样本。

是目前常用的差异蛋白质组研究方法之一［5］ ，通过比较不同疾病情况的蛋白质谱的差异，发现样本中与某种疾病或环境因素损伤可能相关的特异性蛋白质信息，为临床诊断或进行进一步的基础研究提供依据本研究应用 SELDI TOF MS 检测了 27 例渗出性胸液标本及部分相应的血清标本，对获得的蛋白信号进行分析发现：良恶性胸腔积液组血清标本蛋白信号没有明显差别，但胸液标本有 6 个蛋白信号呈现差异。