(精编资料推荐)实验十四血清胆固醇测定(胆固醇氧化酶法).docx

实验十四 血清胆固醇测定（胆固醇氧化酶法）胆固醇的测定方法很多；通常可分为化学试剂比色法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法五大类化学试剂比色法中有直接法和间接法；前者可用血清直接测定， 后者是用溶剂或其它方法提取胆固醇后再作定量 酶法由于操作简便、 结果准确，试剂无腐蚀性，而且因使用特异性酶，大大减少了血液中其它成分的干扰，目前已成为测定胆固醇的主要方法目的】1．了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理，能进行血清胆固醇测定的操作2. 掌握血清胆固醇测定的临床意义原理】血清中总胆固醇 （ TC）包括胆固醇酯 (CE) 和游离型胆固醇 (FC), 酯型占 70%，游离型占30%胆固醇酯酶（ CEH）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（ FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶（ COD）的作用下氧化生成 4- 胆甾烯酮和过氧化氢后者经过氧化物酶（ POD）催化氢与 4- 氨基安替比林（ 4-AAP）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在 500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量反应式如下：胆固醇酯CEH胆固醇 ＋ 脂肪酸胆固醇＋OCOD4- 胆甾烯酮 ＋ H2O22△2H2 O2 ＋ 4- 氨基安替比林 ＋ 酚POD红色醌亚胺【器材】试管、吸管、试管架、微量加样器、恒温水浴箱、分光光度计。

试剂】酶法测定胆固醇多采用市售试剂盒1. 酶应用液 胆固醇酶试剂的组成为：pH6.7 磷酸盐缓冲液 50mmol/L胆固醇酯酶 ≥ 200U/L胆固醇氧化酶 ≥ 100U/L过氧化物酶 ≥ 3 000U/L14- 氨基安替比林 0.3 mmol/L苯酚 5 mmol/L此外还含有胆酸钠和 Triton X-100 ，胆酸钠是胆固醇酯酶的激活剂，表面活性剂Triton X-100 能促进脂蛋白释放胆固醇和胆固醇酯，有利于胆固醇酯的水解2． 5.17 mmol/L （ 200mg /dl ）胆固醇标准液精确称取胆固醇 200mg 溶于无水乙醇， 移入 100ml 容量瓶中， 用无水乙醇稀释至刻度( 也可用异丙醇等配制 ) 操作】取试管 3 支，编号，按下操作表 3-15 酶法测定血清胆固醇操作步骤加入物（ ml） 测定管 标准管 空白管血清 0.02 － －胆固醇标准液 － 0.02 －蒸馏水 － － 0.02酶应用液 2.00 2.00 2.00混匀后， 37℃水浴保温 15 分钟，在 500nm波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度计算】血清胆固醇 (mmol/L)＝测定管吸光度× 5.17标准管吸光度【注意事项】1. 黄疸血清过高的胆红素可还原—部分反应中的 H2O2 ，降低显色反应，使结果偏低。

但测定胆固醇，胆红素对酶法的干扰比化学法小2. 用胆固醇标准液引起的误差较大，故目前提倡采用胆固醇定值血清为标准3. 轻度溶血对测定结果无影响，但明显溶血可使结果增高，此时可用一个不加 COD的空白管从结果中减去后纠正4. 其它影响因素，如维生素 C、谷胱甘肽、氟化物引起负偏差正常参考范围】3.10 ～5.70mmol/L【临床意义】21. 血清胆固醇增高 常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症、糖尿病、肾病综合征、胆管阻塞、甲状腺功能减退2. 血清胆固醇降低 常见严重贫血、甲状腺功能亢进、长期营养不良等结果及分析】【思考题】1．胆固醇有哪些重要的生理功能，血清胆固醇升高对机体最严重的危害是什么？2．胆固醇在体内可转变为哪些物质，如何排泄？3．实验中需要哪几种酶参加，各有什么作用？3。